2024年11月8日，海南医科大学急创学院的于法标教授课题组在国际高水平期刊《Angewandte Chemie International Edition》上发表了题为“Metabolic Acidity/H2O2 Dual-Cascade-Activatable Molecular Imaging Platform Toward Metastatic Breast Tumor Malignancy”的研究论文。该论文报道了一种可被肿瘤相关H2O2和微酸性环境协同激活的近红外二区影像探针HN-PBA，并用于高对比度肿瘤成像及荧光引导手术导航的研究。与传统的“始终开启”探针及单一H2O2激活探针相比，这种双重响应机制可减少假阳性信号干扰，有助于更准确地识别肿瘤并切除原发性和转移性肿瘤。更为重要是，论文中报道的探针能够有效检测直径 ≤ 0.7 mm的肺转移灶，并在临床乳腺癌标本中展示了精确区分病变及正常组织的能力。这一双重刺激响应策略可能为未来诊断探针的设计做出重大贡献。
该研究论文第一作者是海南医科大学青年教师窦昆，通讯作者是海南医科大学青年教师窦昆、于法标教授和韩国高丽大学Jong Seung Kim教授。研究获得了国家自然科学基金青年项目，海南省“南海新星”科技创新人才，海南省重点研发等项目的支持。
原文链接： https://doi.org/10.1002/anie.202419191
完整作者信息：Kun Dou*†[a], Jiao Lu†[a], Yanlong Xing[a], Rui Wang[a], Miae Won[b],[c],[d], Jungryun Kim[b], Fabiao Yu*[a] and Jong Seung Kim*[b],[c]
Key Laboratory of Haikou Trauma, Key Laboratory of Hainan Trauma and Disaster Rescue, Key Laboratory of Emergency and Trauma, Ministry of Education, The First Affiliated Hospital of Hainan Medical University Hainan Medical University, Haikou 571199, China
近红外二区（NIR-II）荧光成像技术因具有高的分辨率和穿透深度在肿瘤诊断中至关重要。 然而，目前的NIR-II探针存在一些局限性，一些探针始终处于激活状态，导致信号强度低，难以区分肿瘤和正常组织，并且探针只能对一种刺激做出响应，这可能导致假阳性信号，因此，需要开发能够响应多种刺激并具有高信噪比的 NIR-II 探针，以提高肿瘤诊断的准确性。
探针HN-PBA具有以下优点，双锁控制机制：HN-PBA探针设计了一种独特的双锁控制机制，需要同时满足酸性肿瘤微环境和H2O2高表达两个条件才能激活荧光信号，有效地减少了非特异性信号和假阳性结果，提高了肿瘤成像的准确性和信噪比。高灵敏度：HN-PBA对H2O2具有高灵敏度，能够在酸性环境中检测到低浓度的H2O2，从而实现对肿瘤的精准定位。高特异性： 由于其双锁控制机制，HN-PBA只在肿瘤组织中被激活，而在正常组织中不发光，从而实现了高特异性肿瘤成像。
图1. 用于成像探针HN-PBA的设计策略
作者首先合成了分子HN-PBA，部分合成路线如下图1所示。接下来，作者首先对探针进行了氢离子和过氧化氢条件下的光学响应，从图3a中可以看到HN-PBA在酸性环境中在 628 nm 处有本征吸收带，当转变为中性和碱性环境，该吸收带逐渐减小，表明HN-PBA中存在 pH 依赖性的分子内螺环化转变。计算的HN-PBA 的PKa值（7.2）表明探针主要以开环形式存在于肿瘤微环境中，在没有 H2O2 的情况下，无论培养基的酸度如何，HN-PBA都显示出可忽略不计的 NIR-II 荧光，表明HN-PBA 通过硼酸酯部分的设计锁定传感活性。
图2 探针的合成
然后，作者研究了 HN-PBA 在与 H+/H2O2 共刺激下的光学响应.图3a 中的吸收光谱显示，与 H2O2 孵育时在酸性条件下 （pH 6.5），HN-PBA 在 628 nm 处的吸收下降，而在 825 nm 附近出现了新的吸收带。然而，在生理条件 （pH 7.4） 下，825 nm 处的吸收显著降低。这些发现表明，H2O2促进了硫醇-BODIPY 供体的加速释放，它与罗丹明在酸性介质中的开环结构相结合，共同恢复了 ICT 过程，并导致 NIR-II 区域 （1,060 nm） 的荧光显著增强。研究使用HN-PBA酸性环境中高特异和敏感的检测 H2O2的可行性，首先研究了HN-PBA（10 μM） 的依赖性吸收和荧光光谱图。
图3 HN-PBA 对 H+/H2O2 的光学响应
如图所示，HN-PBA本身分别在 628/675 nm 处表现出吸收/发射峰。当 H2O2 水平升高时，在 628 nm 处的吸收逐渐降低，而在 825 nm 处观察到吸收明显增加。此外，HN-PBA由于 H2O2的存在，导致 675 nm 处 NIR-I 荧光降低，但在 808 nm 激发下检测到 1,060 nm 处 NIR-II 荧光随着 H2O2含量增加而增加，这些数据表明作者所设计的探针在酸性环境下对H2O2是高度敏感的。
图4 HN-PBA在酸性环境中对H2O2的敏感性和特异性
接下来，为了评估了基于“双锁和钥匙”的显像剂用于精确勾画肿瘤和 NIR-II 成像引导的术中肿瘤切除的可行性。将HN-PBA（100 nM） 静脉注射到皮下 4T1 肿瘤小鼠中，然后进行时间依赖性体内 NIR-II 荧光成像。另外一批小鼠以相同剂量给予市售荧光手术探针吲哚菁绿 （ICG），并接受与实验组相同的成像过程。 ICG给药的小鼠在前 2 小时内，在肝脏中表现出明显的积累，而在 8 小时内在肿瘤区域观察到极低的探针摄取效率以及被快速清除的现象。由于其高背景信号和较短的肿瘤保留时间，ICG 无法提供区分肿瘤边界和邻近组织的最佳成像信号。相比之下，HN-PBA的施用导致肿瘤区域出现特异性荧光信号，表明内源性 H2O2 和酸性肿瘤环境成功激活探针。探针注射后 2 小时可见肿瘤轮廓。随着时间的推移，肿瘤荧光信号逐渐增加并在 24 小时 PI 时达到最大值。此外，注射后 48 小时仍观察到相当大的荧光强度（约占峰值的 90%），背景干扰可以忽略不计，表明HN-PBA为肿瘤干预提供了足够的时间。基于HN-PBA对准确肿瘤定位和高对比度成像的优越特性，在探针给药后 24 小时进行 NIR-II 图像引导的术中皮下肿瘤切除，如图k所示，可以观察到肿瘤的轮廓和边缘（由绿色虚线表示），并在 NIR-II 荧光引导下切除肿瘤区域。手术后，在原始位置未检测到信号，表明肿瘤完全切除。H&E 染色证实了肿瘤中的组织结构，阴性边缘可以忽略不计（黑色虚线），进一步验证了肿瘤探针的可靠性。更重要的是，在切除手术的帮助下，与未治疗组相比，存活率显著提高。
图 5荧光成像引导的手术切除
最后，为了进一步验证HN-PBA精确识别肿瘤组织和划定肿瘤边界的临床能力，作者从患者身上获得新鲜切除的乳腺癌组织，并在原位喷洒HN-PBA后使用 NIR-II 光学系统成像。如图 6 a、b 所示，在HN-PBA给药后 10 分钟可以识别肿瘤边缘，表明探针穿透肿瘤并被内源性 H2O2 和酸环境能有效激活。切除的肿瘤组织的信号强度随着时间的推移逐渐增加，并在 60 分钟内达到最大值（图 6b-c）。并且肿瘤中 a 区的荧光亮度同时比 c 区高 8.1 倍，使其适用于图像引导手术和其他应用。H&E 染色结果表明，难以通过肉眼检查区分的肿瘤区域及其边界可以通过作者所设计的探针HN-PBA划定。
综上所述，作者成功开发了一种双病理参数协同激活的 NIR-II 荧光探针 HN-PBA，用于精确肿瘤勾画和图像并且在其引导下切除原位和转移性乳腺癌。利用弱酸和过表达的 H2O2水平，HN-PBA 在 1060 nm 处表现出强大的 NIR-II 荧光信号，特别是探针的“双锁和钥匙”设计最大限度地减少了非特异性激活和潜在的假阳性，从而使 T/N 比比“始终开启”探针 ICG 和单一生物标志物（H2O2） 激活探针 HN-PBC高 8.2/4.0 倍。来自皮下多发性微肿瘤模型的病理数据表明，HN-PBA 可以精确识别和切除直径低至约 0.25 mm 的手术切缘阴性肿瘤。得益于 HN-PBA 的高分辨率和高特异性 NIR-II 荧光成像，能将原位和转移性乳腺病灶与周围正常组织清晰区分开来，在 NIR-II 荧光成像引导下可以轻松切除直径约 0.7 mm 的微小肺转移病灶。在临床癌症标本中，探针也有效地描绘了难以从视觉上区分的肿瘤病变和边界。
参考文献：
Dou K, Lu J, Xing Y, Wang R, Won M, Kim J, Yu F, Seung Kim J. Metabolic Acidity/H2O2 Dual-Cascade-Activatable Molecular Imaging Platform Toward Metastatic Breast Tumor Malignancy. Angew Chem Int Ed Engl. 2024 Nov 7:e202419191. doi: 10.1002/anie.202419191. Epub ahead of print. PMID: 39511909.
文献课题组简介：
于法标：博士，研究员，博士生导师，2013年毕业于大连理工大学/中科院大连化学物理研究所。国家自然科学基金面上项目、青年项目、地区项目、海南省自然科学基金重点项目、海南省高层次人才项目、中科院人才项目等多项；致力于研究智能诊疗仪器与生物传感工程、生物医学智能材料与临床诊疗
发表高水平论文100余篇。IF>10论文22篇，IF最高62。论文总引11000余次。单篇最高引用超600余次。引用超过300次的12篇，超过100次的13篇。H-index 56。
jong seung kim：韩国高丽大学化学系教授，韩国科学院院士，韩国化学会副主席，韩国光学学会主席， Chemical Society Reviews (RSC)，Chemical Communications (RSC) 责任编辑。2016年获得了韩国政府颁发国家贡献奖和Wiley颁布的ChemPlusChem。主要致力于神经退行性疾病 、药物输送系统、化学探针、光动力/热疗等方面的研究。奖迄今为止，总共在SCI数据库发表了文章412篇，被引30500次，平均每篇文章被引70余次，个人的H-index指数达到90，同时申请了专利累计70项。近5年来更在JACS上发表11篇论文、 Angew上发表2篇论文、Chemical Society Reviews上发表了15篇论文。
