01 背景介绍
对于缺血性卒中，尽快恢复脑血流是挽救缺血组织的关键。然而，血流重新进入脑组织后，部分细胞仍会在氧化应激和炎症反应中继续受损。这种“恢复供血却伴随新的损伤”的缺血再灌注过程，促使研究者关注铁死亡：当细胞的抗氧化防线失衡，含铁反应推动脂质过氧化持续累积，神经元可能因此遭受进一步伤害。
要理解这条损伤链，仅测量终点时的氧化水平还不够。炎症相关的髓过氧化物酶（MPO）可参与生成次氯酸（HOCl），而谷胱甘肽（GSH）是清除氧化物、维持GPX4抗脂质过氧化作用的重要还原力量。再灌注期间，HOCl的产生与GSH的消耗可能此起彼伏；同时，脂滴与脂质代谢、铁死亡密切相关。若能在脂滴附近持续观察这一氧化还原拉锯，就更有机会看清HOCl信号如何随铁死亡进程变化。
难点在于，许多荧光探针与氧化物反应后便无法回到初始状态，只能留下“曾经发生过氧化”的累积信号。此外，要在活体卒中模型中观察脑组织，探针还需要具备进入脑组织和在目标亚细胞区域富集的能力。针对这些限制，作者设计了能够被HOCl点亮、又能被GSH调暗的脂滴靶向探针DX。
02 核心问题
本研究要解决的核心问题并不是简单提高 HOCl 检测灵敏度，而是重新设计探针的响应逻辑与靶向策略。传统氧化应激探针多基于不可逆反应机制，只能提供氧化损伤的累积信息，无法反映 HOCl/GSH 的动态平衡；同时，多数探针难以兼顾血脑屏障穿透、脂滴靶向和可逆监测，限制了其在缺血性卒中中的应用。
围绕这一目标，作者以商业化脂滴染料 BODIPY 493/503 为母体，引入 Se-吗啉作为氧化还原响应开关，构建了脂滴靶向可逆荧光探针 DX。DX 通过 PET 与 ICT 协同机制实现对 HOCl/GSH 的 on-off-on 荧光响应，可在活细胞和活体脑中实时监测氧化还原波动。
因此，本研究的核心目标可以概括为：利用 DX 的可逆成像能力，实时追踪缺血性卒中过程中 HOCl/GSH 的动态变化，并以此揭示 HOCl 积累与铁死亡激活之间的调控关系，为卒中干预提供新的分子靶点。
图1 DX的设计和卒中再灌注期间HOCl与铁死亡关系示意图
① 探针设计与可逆氧化还原响应
为让探针同时具备脂滴定位和往复响应能力，作者以BODIPY为荧光骨架，调整分子脂溶性，再接入硒代吗啉作为氧化还原开关。在初始状态，硒原子参与的光诱导电子转移（PET）使DX荧光较弱；HOCl将其氧化后，这条非辐射途径受到抑制，荧光被“点亮”。随后加入GSH，氧化产物被还原，信号再度减弱。分子内电荷转移（ICT）的改变则共同解释了吸收光谱的位移。DX的log P为2.91，为后续脑组织成像提供了有利的理化基础，但血脑屏障通透性仍需活体验证。
光谱实验首先验证了这一设计。HOCl浓度在0.1–8.0 μM时，DX于580 nm的荧光随浓度线性增强，检出限为70.5 nM；加入15 μM HOCl后，信号约1 min达到平台。再加入GSH，荧光随之减弱，对GSH的线性响应范围为0.01–0.5 mM。交替加入HOCl和GSH，探针在三个循环中仍能重复明暗切换；质谱结果也支持相应的氧化和还原产物。需要区分的是，这些定量指标来自含20%乙醇的PBS缓冲体系，不能直接换算为脑组织中的HOCl浓度。
图2 DX对HOCl及GSH的光谱、选择性和循环响应
② 细胞内源HOCl检测与脂滴定位
溶液中的可逆响应还需进入细胞验证。作者分别在HT-22神经元样细胞和BV-2小胶质细胞中诱导炎症反应：LPS/PMA刺激后DX荧光增强，进一步加入MPO时信号更明显，而MPO抑制剂ABAH可削弱荧光。这组对照支持DX主要报告MPO相关的内源HOCl变化。定位实验中，DX与脂滴染料BODIPY 493/503的Pearson共定位系数达到0.91；与线粒体、溶酶体标记的系数则分别为0.28和0.51。
更关键的是，作者在同一细胞体系中依次改变氧化还原环境：LPS/PMA/MPO诱导后信号变亮，加入可透膜GSH供体GSH-OEt后变暗，再补加HOCl则重新变亮。连续变化说明DX能够响应活细胞内氧化和还原条件的切换，而不只是记录一次性的氧化事件。
图3 内源HOCl成像及脂滴共定位
图4 BV-2细胞中HOCl/GSH刺激下的可逆成像
③ 再灌注细胞模型中的HOCl信号与铁死亡
确认DX能读出动态变化后，作者将其用于模拟卒中再灌注的缺氧缺糖/复氧（OGD/R）BV-2细胞模型。复氧过程中，DX荧光随时间增强，信号较对照组提高超过2.15倍；与此同时，抗脂质过氧化关键蛋白GPX4下调。转录组数据与已知铁死亡相关基因交叉分析得到14个核心基因，通路富集也指向铁死亡和脂质代谢，提示氧化信号增强与铁死亡进展并行。
为了进一步检验两者的联系，研究者在模型细胞中分别给予铁死亡抑制剂Ferrostatin-1（Fer-1）和铁螯合剂去铁胺（DFO）。两种处理均使DX荧光下降；BODIPY-C11和Fe²⁺探针则显示，OGD/R诱发的脂质过氧化及游离铁增加也得到缓解。因此，HOCl相关信号与铁死亡表型并非各自孤立变化。不过，这些实验尚不能单独确定HOCl位于铁死亡过程的哪一因果环节。
图5 OGD/R细胞模型中HOCl、转录组和铁死亡指标
④ 卒中小鼠成像及干预验证
细胞模型中的变化能否在活体脑组织中重现？作者使用大脑中动脉闭塞/再灌注（MCAO/R）小鼠模型，在恢复血流后经尾静脉注入DX。缺血侧脑区荧光随再灌注逐渐增强，约4 h达到峰值；假手术组仅见较弱信号。健康小鼠脑成像及离体分布实验支持DX可以进入脑组织。Fer-1处理后，脑区荧光降低，TTC染色显示梗死面积缩小；组织病理和GPX4、ACSL4等检测也与铁死亡减轻、神经元损伤缓解相吻合。
为直接考察活体信号能否随还原环境改变，作者在再灌注4 h给予GSH-OEt：原本逐渐升高的脑区荧光迅速降低，此后又随着再灌注继续而回升。一次干预后的下降与再次上升，体现了DX用于动态追踪的价值，也提醒我们，单个时间点的荧光强弱不足以概括整个再灌注过程。
图6 MCAO/R小鼠脑区成像、梗死与组织学评价
图7 GSH-OEt干预后脑区荧光的动态变化
04 创新点
1. 脂滴靶向可逆荧光探针 DX 的理性设计
以 BODIPY 493/503为母体，引入 Se-啉氧化还原开关，构建出对 HOCl/GSH 具有 on-off-on 可逆响应的脂滴靶向探针。DX 兼具高灵敏度、快速响应、良好选择性和光稳定性。
2. 同时实现 BBB 穿透、脂滴靶向和可逆氧化还原监测
DX 的 log P 为 2.91，处于有利于 BBB 穿透的范围；静脉注射后 5 min 入脑、150 min 达峰、持续 6 h 以上。与 BODIPY 493/503 的 Pearson 共定位系数达 0.91，可精确锚定脂滴这一氧化应激核心区域。
3. 揭示缺血性卒中中的 HOCl-铁死亡调控轴
在 OGD/R 细胞和 MCAO/R 小鼠中，DX 实时显示 HOCl 在再灌注后积累，并与铁死亡进展密切相关。抑制铁死亡可显著减少 HOCl 产生并减轻脑组织损伤；恢复 GSH 稳态也可快速降低 HOCl 信号。
4．多维度验证氧化还原调控与铁死亡关系
结合转录组测序、KEGG/GO/GSEA 分析、GPX4/SLC7A11/ACSL4 蛋白检测、脂质过氧化成像、Fe2+成像和组织病理学，系统证明 HOCl 积累与铁死亡激活之间的紧密关联。
5. 为卒中分子成像和干预提供新工具与新靶点
该工作不仅展示了可逆分子成像在研究氧化还原调节性细胞死亡中的价值，也提示 HOCl 可作为缺血性卒中中铁死亡相关损伤的关键介质和潜在干预靶点。
05 总结
本研究开发了一种脂滴靶向、可逆响应的荧光探针 DX，用于实时可视化缺血性卒中过程中的 HOCl/GSH 氧化还原动态。DX 基于 BODIPY 骨架，通过引入 Se-吗啉单元实现对 HOCl 的荧光 turn-on 响应和对 GSH 的可逆恢复，可在活细胞和活体脑中动态监测氧化应激波动。
在 OGD/R 细胞模型中，DX 有效反映 HOCl 的时空演化，并结合转录组、生化分析和铁死亡抑制实验，揭示 HOCl 积累与铁死亡激活之间的密切关系。在 MCAO/R 小鼠模型中，DX 表现出良好的 BBB 穿透和脑内滞留能力，可在再灌注后实时成像 HOCl 产生；抑制铁死亡可显著降低 HOCl 信号并减轻脑损伤，而恢复 GSH 稳态可快速逆转 HOCl 积累。
整体来看，该工作将可逆分子成像与卒中铁死亡机制研究相结合，揭示了 HOCl-铁死亡调控轴在缺血性卒中中的重要作用，为研究氧化还原调节性细胞死亡提供了新的成像策略，也为缺血性卒中的诊断和干预提供了潜在靶点。
原文链接：https://doi.org/10.1021/acs.analchem.6c04276
