使用线粒体靶向的近红外荧光探针实时评估肺纤维化小鼠模型中的过氧化氢损伤

ACS Sens. 2021, 6, 3, 1228–1239；Real-Time Evaluation of Hydrogen Peroxide Injuries in Pulmonary Fibrosis Mice Models with a Mitochondria-Targeted Near-Infrared Fluorescent Probe，https://doi.org/10.1021/acssensors.0c02519

特发性肺纤维化（IPF）是一种致命性慢性肺病，其病因不明，发病机制尚不明确且预后不良，目前除肺移植外没有其他有效治疗方法。目前，越来越多的证据表明，以过量产生活性氧（ROS）为特征的氧化应激是肺纤维化的重要分子机制。H₂O₂在生理和病理过程中起着更重要的作用，H₂O₂具有反应性较低，半衰期较长，较容易在质膜和细胞膜扩散的物理化学性质。在特发性肺纤维化发生过程中，H₂O₂起重要的促进作用。

近期，我室功能材料与分子影像技术创新团队于法标教授设计并合成了一种线粒体靶向的近红外小分子荧光探针（Mito-Bor），可以用于检测活细胞和体内内源性H₂O₂的变化。Mito-Bor具有光化学稳定性，对过氧化氢具有高灵敏度和选择性。相关成果以“Real-time evaluation of hydrogen peroxide injures in pulmo-nary fibrosis mice models with a mitochondria-targeted near-infrared fluorescent probe”为题发表在国际化学权威杂志ACS Sensors上（DOI: 10.1021/acssensors.0c02519）。

Chemical structure and response mechanism of the probe Mito-Bor towards H₂O₂.

由于线粒体是H₂O₂的主要来源，因此Mito-Bor的线粒体靶向能力对于检测H₂O₂的水平变化至关重要。接下来，我们使用A549细胞通过线粒体共定位分析评估了探针Mito-Bor的线粒体定位性能。选择商业线粒体染料（Mito Tracker Green FM染料）与探针Mito-Bor共孵育。将细胞与Mito-Bor和Mito Tracker Green FM染料孵育30分钟后，将细胞用新鲜细胞培养基洗涤3次，然后成像。如图所示，Mito Tracker Green FM染料的荧光在绿色通道中，而探针Mito-Bor在红色通道中发出荧光。两个通道的每个像素的颜色对表示一个高相关图（图2D）。相关分析表明，皮尔逊系数为Rr = 0.98，曼德斯系数为m1 = 0.99和m2 = 0.98。我们还通过超分辨率成像技术验证了Mito-Bor在线粒体定位中的适用性。图中图像是从激光扫描共聚焦显微镜获得的超分辨率图像，显然表明了线粒体的定位。因此，Mito-Bor可以选择性地堆积在线粒体而不是其他细胞器中。

Mitochondrial colocalization with super-resolution imaging in A549 cells.

在探针细胞毒性检测实验中，细胞存活率良好，这表明该探针对细胞具有低生物毒性并且能够用于活细胞检测，然后用激光扫描共聚焦显微镜对Mito-OH进行细胞内成像。在与Mito-OH共孵育后，A549细胞和PC9细胞在0至60分钟内显示出荧光强度的逐渐增加，这表明探针已与细胞中的过氧化氢反应并释放荧光团。流式细胞术分析的结果与共聚焦显微镜成像结果一致。在Mito-OH用于研究肺纤维化细胞模型建立过程中，过氧化氢的波动随着TGF-β1刺激时间的延长，荧光强度变强，表明成纤维细胞氧化应激水平越来越高，并且细胞中过氧化氢的量逐渐增加。在流式细胞术分析中也出现了相同的结果。随着实验组细胞刺激时间的延长，α-SMA（一种间充质细胞标记蛋白）的表达逐渐增加。同时，促纤维化因子PAI-1显示出相同的趋势。然而，作为上皮细胞蛋白标志物代表的E-钙粘蛋白的表达显示出下调趋势，表明通过TGF-β1刺激诱导纤维化不断进展。在博来霉素诱导的肺纤维化小鼠模型中，GKT的干预降低肺部的氧化应激水平，减少过氧化氢的产生，有利于延缓疾病的进展，缓解肺纤维化症状。

Fluorescence imaging of H₂O₂ in bleomycin-induced pulmonary fibrosis bleomycin (BLM) mice models