Shedding Light on Lysosomal Malondialdehyde Affecting Vitamin B12 Transport during Cerebral Ischemia/Reperfusion Injury

揭示脑缺血再灌注损伤中溶酶体丙二醛对维生素B12转运的影响

Di Su,Ran Zhang, Xin Wang,* Qi Ding, Feida Che, Zhenzhen Liu, Jingwen Xu, Yuying Zhao,Kunqian Ji, Wei Wu,* Chuanzhu Yan,* Ping Li,* and Bo Tang*

Journal of the American Chemical Society，2023，145，22609-22619， DOI: 10.1021/jacs.3c07809

主讲人：周琴 2024年3月10日

研究进展：

   脑缺血再注灌损伤（CIRI）通常伴有同型半胱氨酸（Hcy）水平的上调，从而导致一系列的神经病变。维生素B12疗法是降低Hcy水平以治疗CIRI的理想治疗手段。然而，最近临床试验发现该疗法无效，这可能是由于维生素B12在CIRI过程中的运输受到了干扰。CIRI的生理病理学与溶酶体中的氧化应激密切相关，因此，可能是CIRI期间的氧化应激阻碍了维生素B12的运输。溶酶体丙二醛（MDA）是溶酶体氧化应激的生物标志物，并且极易导致溶酶体中酶或蛋白质的损伤。因此，可能是溶酶体MDA上调损伤了钴胺递运蛋白（LMBD1）的功能而阻碍维生素B12的运输。但是目前缺乏能够实时、原位监测大脑溶酶体MDA的精密工具来进行验证。

解决方案： 

   在本文中，作者开发了一种全新的用于测量溶酶体MDA的荧光显影剂Lyso-MCBH，该荧光显影剂由核心基团香豆素、靶向基团吗啉、识别基团酰肼三部分构成。其中，酰肼基团会使香豆素荧光猝灭，当酰肼基团与MDA反应后，该荧光显影剂在520 nm发出明亮荧光。因此，该荧光显影剂能够靶向溶酶体并特异性检测MDA，对溶酶体MDA具有良好的选择性（图1）。将该荧光显影剂用于细胞成像，成功实现了活细胞中MDA水平波动的实时、原位可视化。此外，小鼠大脑的活体双光子成像揭示了过量的溶酶体MDA会阻碍维生素B12从溶酶体向细胞质的运输，从而影响维生素B12降低Hcy水平的功效（图2）。通过对维生素B12转运受阻原因的进一步探讨，发现是溶酶体MDA通过酰基化修饰损害了转运蛋白LMBD1的功能，这一发现预计将提供一个潜在的治疗靶点。

要点：

1.在本文中，作者开发了一种全新的用于测量溶酶体MDA的荧光显影剂Lyso-MCBH，该荧光显影剂由核心基团香豆素、靶向基团吗啉、识别基团酰肼三部分构成。其中，酰肼基团会使香豆素荧光猝灭，当酰肼基团与MDA反应后，该荧光显影剂在520 nm发出明亮荧光。因此，该荧光显影剂能够靶向溶酶体并特异性检测MDA，对溶酶体MDA具有良好的选择性（图1）。

2. 测定Lyso-MCBH与不同浓度MDA反应的荧光强度。随着MDA浓度从0逐渐增加到70 μM，Lyso-MCBH在520 nm处的荧光强度呈现线性增强（图1d）。荧光强度与MDA浓度的线性方程为：F = 7.30 [MDA]（μM）+ 61.17，线性相关系数为0.999，检测限为0.87 μM（图1 e）。上述数据表明，Lyso-MCBH对于病理生理学MDA检测具有适当的检测范围和灵敏度，32 - 34适用于在溶酶体pH环境下准确检测MDA。

3.为了研究LysoMCBH对MDA的荧光响应是否具有特异性，我们测量了LysoMCBH对各种生物相关物质的响应，包括活性羰基物质（RCS）、活性氧物质（ROS）、金属离子、氨基酸、还原物质等。如图1g所示，当Lyso-MCBH与其他生物活性物质孵育时，520 nm处的荧光很微弱。只有当Lyso-MCBH与MDA孵育时，520 nm处的荧光才显著增强。这些结果证明Lyso-MCBH对MDA具有特异性荧光响应，其他竞争生物物种对其几乎没有干扰。考虑到溶酶体是酸性细胞器（pH 4.5 - 5.0），我们测量了不同pH值对Lyso-MCBH对MDA的检测是否有干扰。结果表明，在pH 4.0−8.0范围内，Lyso-MCBH本身的荧光几乎没有波动，而Lyso-MCBH与MDA的反应在酸性环境下具有更好的荧光响应，这可能是由于酸性环境更有利于MDA和肼的环化和脱水（图1f）。

4. 为了确认荧光信号的变化是由MDA水平的变化引起的，在加入H2 O2之前，用L-肌肽（MDA清除剂）预处理PC 12细胞30分钟。成像结果描述了清除组的荧光明显弱于刺激组的荧光（图2a-d），证明荧光信号的变化确实代表了MDA水平的通量。基于上述成像结果，可以得出结论，Lyso-MCBH对MDA具有高选择性，并且可以实时和原位地观察活细胞中MDA水平的波动。

5.为了探索Lyso-MCBH是否能够准确靶向溶酶体，进行了Lyso-MCBH与溶酶体的共定位实验。用0.25 mM H2 O2刺激PC 12细胞10 min后，用50 μM Lyso-MCBH孵育细胞30 min，再用1 nM LysoTracker Deep Red孵育10 min。观察到Lyso-MCBH的绿色荧光通道与市售染料的红色荧光通道重叠。如图2 e所示，绿-红荧光通道重叠良好，共定位系数为0.90，证明Lyso-MCBH进入细胞后可精确靶向溶酶体。此外，为了进一步验证LysoMCBH是否仅特异性靶向溶酶体，还对Lyso-MCBH与其他细胞器商业染料的共定位进行了成像。图2 e显示，Lyso-MCBH与线粒体、内质网和高尔基体商业染料的重叠很差，共定位系数分别为0.29、0.25和0.68，证明Lyso-MCBH不定位于上述细胞器中。上述实验表明，Lyso-MCBH可特异性靶向溶酶体，并用于溶酶体MDA水平变化的荧光可视化。

6.在通过荧光成像确定Lyso-MCBH具有追踪活体系统中溶酶体MDA的能力后，通过Lyso-MCBH鉴定CIRI下的溶酶体MDA水平。首先，在细胞水平上观察缺血/再灌注（IR）下溶酶体MDA的含量。成像结果显示，IR组的荧光比对照组更亮，在MDA清除剂预处理下，IR组的荧光显著降低（图3a-d）。以上数据表明，IR下溶酶体MDA水平升高，并且每隔10 min还直观监测到IR下PC 12细胞中溶酶体MDA的动态波动，如图3e、f所示，随着IR时间的延长，荧光逐渐升高，说明IR下溶酶体MDA浓度逐渐升高。利用LysoMCBH，在IR下PC 12细胞中溶酶体MDA水平的上调首次被生动地可视化。

7.在体内成像实验之前，进行Lyso-MCBH的体内毒性实验和注射时间优化实验（图4 b和S13）。MCAO/再灌注组和假手术组腹腔注射LysoMCBH（500 μM，150 μL）1.25 mg/kg，持续30 min，并用2.5%三溴乙醇（320 μL）400 mg/kg麻醉。随后，通过双光子激光共聚焦显微镜追踪小鼠脑中的溶酶体MDA水平（图4a）。成像结果显示，与假手术组相比，MCAO/再灌注组的脑中的荧光显著增强（图4c，d），这与细胞成像一致。上述结果表明，MCAO/再灌注组小鼠脑内溶酶体MDA含量明显高于假手术组。Lyso-MCBH的成像深度可达200 μm，具有足够的组织穿透性，可用于脑成像。值得注意的是，这是第一次研究实时和原位捕获在MCAO/再灌注小鼠脑中升高的溶酶体MDA水平。

总结与展望：

   为探讨维生素B12在CIRI治疗中的不良临床疗效，从溶酶体氧化应激可能阻碍维生素B12转运的角度出发，构建了一种荧光成像材料Lyso-MCBH，用于实时和体内追踪溶酶体氧化应激生物标志物溶酶体MDA。通过使用Lyso-MCBH，首次实时和原位跟踪了CIRI下溶酶体MDA的增强水平。结合生物技术，发现过多的溶酶体MDA通过阻碍维生素B12从溶酶体转运到细胞质来影响维生素B12降低Hcy水平的功效。进一步探讨维生素B12转运受阻的原因，发现溶酶体MDA下调了溶酶体膜上维生素B12转运蛋白LMBD 1，并通过羰基化修饰关键位点影响LMBD 1的转运功能。总体而言，我们在这项工作中开发的材料Lyso-MCBH具有足够的组织穿透性，可用于监测活体小鼠大脑中的溶酶体MDA，未来将开发具有多光子，NIR-II，光声或X射线特性的材料，以实现更深的组织穿透成像。最重要的是，他们的工作提供了一个有说服力的解释，缺乏有效的维生素B12治疗降低Hcy水平下CIRI，它提出了一个有前途的潜在治疗靶点。