Ultra-high dose rate radiotherapy overcomes radioresistance in head and neck squamous cell carcinoma

超高速剂量率放疗克服头颈部鳞癌放疗抵抗的机制研究

原文出处：https://www.nature.com/articles/s41392-025-02184-0

主讲人：涂茂婷，2026年3月15日

一、研究背景

头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）是全球第六大常见恶性肿瘤，每年新增病例约90万例，死亡超45万例，尽管多模式治疗取得进展，但死亡率仍居高不下。放疗作为 HNSCC 根治性治疗的核心手段，适用于早期及局部晚期患者，具有无创性和功能保留优势。然而，50%-60% 的患者接受放疗后会出现局部控制失败，进展为复发或转移性疾病。

复发/转移性 HNSCC 的挽救治疗（如再放疗）受限于关键器官的累积毒性，易引发放射性骨坏死、吞咽困难等严重并发症，显著降低患者生活质量和生存率。HNSCC 放疗抵抗的机制复杂且相互关联，主要包括 DNA 损伤修复增强、肿瘤缺氧微环境、癌症干细胞富集、外泌体介导的癌基因传递、肿瘤免疫微环境（TiME）紊乱等。目前临床可用的放疗增敏策略（如顺铂、西妥昔单抗、免疫检查点抑制剂等）效果有限，逆转放疗抵抗仍是未被满足的临床迫切需求。

过去几十年，临床放疗技术创新主要聚焦物理参数优化（剂量分布精准度、射线能量调节），但传统放疗（Conv-RT）已接近物理优化理论极限，难以突破放疗抵抗瓶颈，亟需转向生物学导向的创新放疗模式。超高速剂量率放疗（UHDR-RT）以≥40Gy/s 的超高速率在毫秒级脉冲内递送剂量，已被证实可差异化调控正常组织与肿瘤组织的放射应答，在保护正常组织的同时，有望突破肿瘤放疗抵抗，且能减少放疗周期、降低医疗成本，是极具转化潜力的放疗技术。

高能 X 射线（HEX）是临床放疗中应用最广泛的射线类型，具有穿透深、发散性低、成本可控等优势，但受限于转换效率和技术挑战，HEX 基 UHDR-RT 的研发进展缓慢。此前已有研究报道 HEX 基 UHDR-RT 对正常组织的保护作用，但尚未有研究系统探究其逆转 HNSCC 放疗抵抗的 efficacy 及分子机制。本研究团队自主研发高功率回旋加速器，在靶距0.8m处实现100Gy/s 的超高剂量率输出，为开展 HEX 基 UHDR-RT 的相关研究提供了核心技术支撑。

二、核心研究内容与解决方案

本研究的核心目标是明确 HEX 基 UHDR-RT 是否能逆转 HNSCC 放疗抵抗，并阐明其分子机制。通过构建放疗抵抗细胞株与动物模型，结合多组学分析、免疫功能验证等技术，揭示 UHDR-RT“直接诱导 DNA 损伤 + 激活肿瘤免疫微环境” 的双重作用机制，为放疗抵抗 HNSCC 提供新型治疗策略。

（一）关键实验模型构建与验证

1. 放疗抵抗细胞模型：通过对人舌鳞癌细胞 CAL33 和小鼠口腔鳞癌细胞 MOC1 进行累计剂量70Gy 的分次照射，成功构建放疗抵抗细胞株CAL33_R和MOC1_R，经CCK-8实验和克隆形成实验验证，其增殖活力和克隆形成能力显著高于亲本敏感株。

2. 动物模型：

o 免疫完整模型：C57BL/6J小鼠皮下接种MOC1或MOC1_R细胞，用于评估UHDR-RT对肿瘤生长及TiME的调控作用；

o 免疫缺陷模型：BALB/C-nude 裸鼠接种人喉鳞癌放疗抵抗组织，构建患者源异种移植（PDX）模型，用于排除免疫系统干扰，单独验证 UHDR-RT 的直接杀伤作用。

3. 放疗设备与参数：采用自主研发的高功率回旋加速器，UHDR-RT的峰值剂量率为176 Gy/s，平均剂量率88Gy/s；Conv-RT 的峰值剂量率为176Gy/s，平均剂量率约3.095Gy/min，确保两组照射的剂量分布、电子能量等物理参数一致，仅剂量率存在差异。

（二）核心研究结果与机制解析

1. 体外实验：UHDR-RT 特异性抑制放疗抵抗细胞的恶性表型并加剧 DNA 损伤

· 增殖与侵袭抑制：与Conv-RT相比，UHDR-RT可使CAL33_R细胞活力降低30%，划痕愈合速度和Transwell穿膜细胞数显著减少，表明其能有效抑制放疗抵抗细胞的增殖、迁移和侵袭能力；而对放疗敏感株CAL33，UHDR-RT与Conv-RT的抑瘤效果无显著差异。

· DNA 损伤与凋亡诱导：UHDR-RT 处理后，CAL33_R 细胞的γ-H2AX 阳性细胞数增加近50%，线粒体膜电位降低2倍，死细胞比例和凋亡率显著升高，证实其可通过加剧 DNA 双链断裂、破坏线粒体功能，诱导放疗抵抗细胞凋亡。

· 免疫原性细胞死亡（ICD）激活：UHDR-RT 显著上调CAL33_R细胞中钙网蛋白、HMGB1、ATP等ICD 标志物水平，且降低活性氧（ROS）水平，提示其逆转放疗抵抗主要依赖直接DNA损伤，而非ROS介导的间接细胞毒性。

2. 体内实验：UHDR-RT 通过激活 TiME 逆转放疗抵抗

· 肿瘤生长抑制：在C57BL/6J小鼠模型中，UHDR-RT可使MOC1_R肿瘤体积减少近1倍，而对MOC1敏感肿瘤的抑制效果与Conv-RT相当；Ki-67染色显示肿瘤增殖活性降低2倍，TUNEL 染色显示凋亡率增加4倍，γ-H2AX 染色显示 DNA 损伤水平增加3倍，与体外实验结果一致。

· 远隔效应验证：UHDR-RT不仅能抑制照射侧肿瘤生长，还能显著降低MOC1_R小鼠的对侧非靶肿瘤体积和脾脏重量，证实其可激活全身性抗肿瘤免疫反应。

· PDX 模型实验：在免疫缺陷的 PDX 模型中，UHDR-RT仅轻度降低肿瘤体积（无统计学差异），但仍能使DNA损伤水平增加2倍，且显著下调DNA损伤修复相关通路（如氧化磷酸化、谷胱甘肽代谢等），表明直接 DNA 损伤是UHDR-RT的固有作用，但 TiME 激活是其有效逆转放疗抵抗的核心前提。

3. 多组学分析：锁定TiME激活相关分子与通路

· 转录组 + 蛋白组整合分析：对MOC1_R肿瘤组织进行RNA测序和Olink蛋白组学检测，发现UHDR-RT组有7个核心免疫相关蛋白显著上调（PDCD1LG2、IFN-γ、IL-1β、CCL17、IL-27、CXCL9、CCL4），且这些蛋白与转录组差异基因富集的51个交叉通路高度关联，主要涉及 T 细胞激活、细胞因子 - 细胞因子受体相互作用等免疫相关通路。

· 免疫浸润分析：Cybersort分析显示，UHDR-RT组的CD8⁺T细胞浸润比例和M1/M2巨噬细胞比值显著升高，证实TiME激活的核心细胞亚群为CD8⁺T细胞和巨噬细胞。

4. 免疫机制验证：CD8⁺T细胞与巨噬细胞的协同作用

· 细胞定位与表型验证：免疫荧光和流式细胞术证实，UHDR-RT组MOC1_R肿瘤中CD8⁺T细胞浸润增加近20%，M1巨噬细胞比例增加10%，M2巨噬细胞比例降低超20%，且CD8⁺T细胞与M1巨噬细胞存在显著共定位。

· 抗体阻断实验：在C57BL/6J小鼠模型中，使用抗CD8a抗体阻断CD8⁺T细胞后，UHDR-RT的抑瘤效应几乎完全消失（肿瘤体积增加近3倍）；使用抗CSF1R抗体抑制巨噬细胞后，抑瘤效应显著减弱（肿瘤体积增加近 1 倍）；而使用抗PD-1抗体激活CD8⁺T细胞后，抑瘤效应进一步增强，证实CD8⁺T细胞是核心效应细胞，巨噬细胞为关键辅助细胞，二者协同介导TiME激活。

5. 体外细胞互作：旁分泌正反馈环路的鉴定

· 自主调控效应：单独培养的巨噬细胞（BMDMs）和T细胞（SPTCs）经MOC1_R条件培养基处理后，UHDR-RT 可直接促进巨噬细胞 M1 极化和CD8⁺T细胞激活（IFN-γ分泌增加），且该效应仅存在于放疗抵抗微环境中。

· 旁分泌趋化作用Transwell实验显示，UHDR-RT激活的CD8⁺T细胞可分泌趋化因子促进巨噬细胞迁移，反之极化的巨噬细胞也能招募CD8⁺T细胞浸润。

· 正反馈环路构建UHDR-RT激活的CD8⁺T细胞分泌IFN-γ，促进巨噬细胞向M1型极化；M1巨噬细胞分泌CXCL9，进一步招募并激活CD8⁺T细胞，形成 “CD8⁺T细胞-IFN-γ-M1巨噬细胞- CXCL9”的旁分泌正反馈环路，持续放大 TiME 激活效应。

（三）核心技术要点

1. UHDR-RT对放疗抵抗HNSCC的抑制具有特异性，对敏感肿瘤的效果与Conv-RT相当，其优势在于同时具备直接DNA损伤诱导和TiME激活的双重作用；

2. 高能X射线基回旋加速器的成功研发为研究提供了关键技术支撑，其高剂量率、高稳定性的特点满足了临床转化的潜在需求；

3. 多组学整合分析与功能验证相结合的研究策略，实现了“分子靶点-信号通路-免疫细胞- 环路机制”的精准锁定；

4. 远隔效应的发现证实 UHDR-RT 可激活全身性抗肿瘤免疫，为转移性 HNSCC 的治疗提供了新的思路；

5. UHDR-RT与PD-1抑制剂的协同增效效应，为临床联合治疗方案设计提供了实验依据。

三、研究总结与展望

（一）研究总结

本研究首次系统证实高能X射线基 UHDR-RT 可有效逆转HNSCC放疗抵抗，其核心机制为“直接诱导DNA损伤+激活肿瘤免疫微环境”的双重作用：

1. UHDR-RT通过抑制 DNA 损伤修复通路，加剧放疗抵抗细胞的 DNA 双链断裂，直接诱导细胞凋亡；

2. 同时，UHDR-RT激活CD8⁺T细胞与巨噬细胞形成旁分泌正反馈环路，显著改善肿瘤免疫抑制微环境；

3. 免疫完整模型中的远隔效应和PDX模型中的轻度抑瘤效应，明确了 TiME 激活是UHDR-RT逆转放疗抵抗的核心主导作用，直接DNA损伤为辅助作用；

4. 该研究为UHDR-RT的临床转化提供了坚实的实验基础，同时为放疗抵抗 HNSCC 提供了新型治疗策略。

（二）研究局限性

1. 未深入探究HPV感染状态对UHDR-RT疗效的影响，而HPV感染与HNSCC的放疗敏感性密切相关，其可能通过调控癌症干细胞表型和肿瘤微环境影响治疗效果；

2. 研究中使用的放疗抵抗模型均为继发性抵抗模型，UHDR-RT对原发性放疗抵抗的作用效果仍需进一步验证；

3. 临床转化仍需解决设备小型化、剂量率个体化调控等技术问题，且需开展多中心临床研究验证其安全性和有效性。

（三）未来研究展望

1. 拓展模型研究：构建HPV阳性/阴性HNSCC放疗抵抗模型，探究病毒感染状态对UHDR-RT疗效的影响及机制；建立原发性放疗抵抗模型，验证UHDR-RT的普适性；

2. 机制深化探究：深入解析 IFN-γ/CXCL9 环路调控CD8⁺T细胞与巨噬细胞互作的分子细节，挖掘更多关键调控靶点；

3. 联合治疗优化：探索UHDR-RT与CXCL9模拟肽、M2巨噬细胞抑制剂等的联合治疗策略，进一步增强 TiME 激活效应；

4. 临床转化推进：优化回旋加速器的临床适配性，开展早期临床试验，评估UHDR-RT在放疗抵抗HNSCC患者中的安全性和疗效，同时探索CD8⁺T细胞浸润、M1/M2 比值等生物标志物的预测价值。