【思路拔高】庖丁解牛，线粒体功能障碍这样研究发一区高分！

线粒体在真核细胞中由双层高度特化的单位膜围成，它对于细胞内最基本的能量转化、维持细胞正常的生理活动具有重要作用。多项研究表明，在生物的生长、发育、代谢、疾病、死亡以及生物进化等方面，线粒体参与其中进行调控或信号传导，且还参与细胞内Ca2+的稳态、活性氧（ROS）的产生以及细胞色素C的释放。

也因此，线粒体可作为评估细胞病变或损伤的最敏感指标。之前，我们也写过关于近年研究火爆的SASP与线粒体功能障碍的相关文章解读（Nature重磅！延缓衰老！线粒体协调衰老相关的细胞凋亡），感兴趣的小伙伴不妨多多支持哦~

今天，小编将通过今年发表在《MedComm》（IF= 9.9 自引率仅为2.0%）上的几篇文章。

来分析并总结线粒体功能障碍相关研究的发文套路，我们将主要围绕以下几个问题展开，赶快收藏吧~

1.线粒体功能障碍适用于哪些疾病的研究？

2.线粒体功能障碍可能通过哪些机制发挥作用？

3.线粒体功能障碍的检测及验证方法有哪些？

近年的研究表明，线粒体参与众多疾病的发生发展，且与各项疾病的重要关联点在于，首先，线粒体是产生能量的重要细胞器，当其机能下降时，细胞的活性也会下降；其次，发生氧化应激是间接或直接导致线粒体功能障碍的关键因素；再次，线粒体的形态对于维持线粒体完整性及功能至关重要。那么，小编具体举几个例子：

1.氧化应激相关疾病：氧化应激与心血管疾病、癌症、神经退行性疾病和糖尿病等疾病密切相关。

2.心血管疾病：线粒体的形态控制对于维持心肌动态平衡至关重要。

3.癌症：线粒体膜中磷脂含量升高可增强线粒体完整性，从而克服化疗诱导的肿瘤细胞凋亡。另外，癌细胞的高氧化应激状态，导致活性氧增多自由基损伤DNA，线粒体基因突变调控肿瘤的发生、发展、侵袭和转移。

4.神经退行性疾病：Aβ通过诱导AD脑海马神经元自由基生成和氧化应激间接导致线粒体功能障碍，这已成为AD的重要致病变化。此外，线粒体相关基因PINK1/Parkin是帕金森氏病的致病基因。

5.糖尿病：mtDNA突变会降低线粒体功能，导致低胰岛素血症型糖尿病，另一角度看，氧化应激会导致胰岛素抵抗和胰岛素分泌下降，从而加速糖尿病的发展。

6.衰老：线粒体ROS的产生和mtDNA突变积累的增加被认为是促进线粒体功能障碍引起衰老的主要因素，也有研究报道，mtDNA突变积累引起的衰老，会导致怀孕率下降和流产率的上升（不孕症）。

最近越来越多的研究发现线粒体在细胞中的作用除了产生腺苷5’-三磷酸（ATP），作为“细胞能量站”外，还可以通过氧化磷酸化释放活性氧（ROS）。也因此，线粒体的质量和活性与多种细胞功能如增殖、细胞信号传导、代谢、基因表达、自噬、衰老和免疫应答等关系密切。

那么，如何明确我们的研究与线粒体功能障碍有关呢？基本分为两种情况：

1.已知关键基因/物质A与线粒体、氧化应激等功能相关；

2.未知关键基因/物质/修饰A，通过组学差异分析，通过功能富集分析发现与线粒体功能相关，如ATP酶活性结合、偶联ATP、二磷酸腺苷结合等。

图1 源自参考文献

说到检测方法，首先，就要从培养的细胞（体外实验）或者提取的组织（体内实验）中分离线粒体，首先是使用差速离心法得到线粒体粗提物，然后根据质谱及组学数据进一步调整提取相关方案，如使用不同溶液与粗提物调配均质液，及离心速率分离得到完整且成球状的线粒体。

提取到线粒体后，我们通过什么手段检测并评估是否发生了线粒体功能障碍呢？线粒体功能障碍通常表现为线粒体膜电位损伤、ATP生成减少和线粒体质量下降等。

1.形态学观察

我们可以通过透射电镜（TEM）观察线粒体的形态是否完整，Mito-tracker（探针）染色来测定线粒体的形态及分布。

图2 源自参考文献

2.ROS水平检测

可通过流式细胞术检测ROS水平（图3左），也可通过使用MitoSOX Red试剂来使线粒体中显性ROS（主要通过线粒体超氧化物）实现可视化（图3右）。

图3 源自参考文献

3.线粒体呼吸耗氧率检测（OCR）

我们可以通过Seahorse实验评估线粒体耗氧率（Oxygen consumption rate，OCR）（如图4E-G）。

图4 源自参考文献

4.ATP含量检测

采用荧光素酶（Firefly luciferase）检测分析ATP的含量，在一定浓度范围内，荧光的产生与ATP的浓度成正比，结果如图4H。

5.线粒体膜电位检测

采用JC-1染色定量分析线粒体膜电位（ΔΨm）。线粒体膜电位降低，即JC-1由红转红（j-聚集体）转到绿色（单体）荧光，是细胞凋亡早期的标志性信号。

图5 源自参考文献

6.线粒体完整度及功能检测

线粒体氧化呼吸链系由一系列的递氢体和递电子体按一定的顺序排列组成的连续反应体系代表着线粒体的最基本功能，可以通过RCR定量检测试剂盒来检测其线粒体外膜及功能完整性和氧化磷酸化效率，RCR为加入ADP时（Stage3）的呼吸速率与ADP耗竭后（Stage4）的呼吸速率之比。

线粒体的呼吸耗氧联着ADP与Pi合成三磷酸腺的磷酸化反应，ADP/0值是指线粒体每消耗1 mol氧原子的同时，生成ATP的摩尔数。RCR通常与ADP/0比值一起，成为衡量线粒体结构完整与否及气化磷酸化联程度的灵敏指标，在线粒体氧化呼吸链功能受损的情况下，S3值、RCR、ADP/0比值下降，S4值则显著高。

体内验证并检测线粒体功能障碍可以使用哪些方法呢？

体内实验如前所述，同样可以通过差速离心法提取组织中的线粒体，进行后续检测。体内检测主要通过RCR、检测ADP/0比、检测F1-F0 ATP酶活性等方法评估线粒体功能。