1.要注意溶剂的互溶性，不相混溶的溶剂不能用作梯度洗脱的流动相。另外有些溶剂在一定比例内混溶，超出范围后就不互溶，使用时更要引起注意。

2.当有机溶剂和缓冲液混合时，还可能析出盐的晶体，尤其使用磷酸盐时需特别小心。

1.梯度洗脱所用的溶剂纯度要求更高，以保证良好的重现性。进行样品分析前必须进行空白梯度洗脱，以辨认溶剂杂质峰。

2.因为弱溶剂中的杂质富集在色谱柱头后会被强溶剂洗脱下来。用于梯度洗脱的溶剂需彻底脱气，以防止混合时产生气泡。

1.由于任何杂质微粒都会磨损柱塞、密封环、缸体和单向阀，因此应预先除去流动相中的杂质微粒。

2.流动相最好在玻璃容器内蒸馏，而常用的方法是过滤，可通过0.45um滤膜过滤后使用，现配现用。输液泵的滤器应经常清洗或更换。

1.如果将含缓冲液的流动相留在泵内，尤其是在停泵过夜或更长时间的情况下，或由于蒸发、泄漏，甚至只是由于溶液的静置，就可能析出盐的微细晶体，这些晶体将和上述固体微粒一样会损坏密封环和柱塞等。

2.因此，必须用纯水将泵充分清洗后，再换成适合于色谱柱保存或有利于泵维护的溶剂（对于反相键合硅胶固定相，可以是甲醇或甲醇-水）。

压力降低的原因则可能是管路有泄漏或堵塞。检查堵塞或泄漏时应逐段进行。

在进行梯度洗脱时，由于多种溶剂混合，而且组成不断变化，因此带来一些特殊问题，必须充分重视。

调节流速时应该缓慢进行，在进样时阀的转动不能过快，避免导致压力和温度的急剧变化及任何机械震动影响柱内填料的填充状况。

一般说来色谱柱不能反冲，除非特别指明该柱可以反冲时，才可以反冲除去留在柱头的杂质。否则反冲会迅速降低柱效，严重的甚至损坏色谱柱。

为了避免将来源于色谱系统的污染或样品的污染直接进入柱内，从而缩短色谱柱的使用寿命，需要在进样器和色谱柱之间连接保护柱从而截取不溶性颗粒和吸附样品基质中的杂质。使用保护柱可大大降低分析柱受污染的程度，延长分析柱使用寿命。