生物屋 2024-03-16 23:38 上海
在第一期16种细胞因子的检测技术(详见实验技术(一)：史上最全的16种细胞因子检测技术)中，主要介绍的是一些常见和通用的检测技术。在这一期中，我们重点介绍了额外16种细胞因子检测的最新技术，包括HTRF、AlphaLISA、DNA微阵列、抗体芯片、SMC、免疫PCR、PLA、IMR、PhLoC、质谱细胞术、基于荧光/SPR/SERS/电化学/CRISPR/Cas13a的细胞因子生物传感器等，以及一些检测技术的比较。
[细胞因子概述]
·根据其作用，细胞因子也可分为促炎性或抗炎性，促炎细胞因子包括IL-1、IL-6、IL-8、IL-11、IL-12、TNF-α、IFN-γ和 TGF-β等，促进炎症反应并倾向于刺激免疫活性细胞。相反，抗炎细胞因子，如 IL-4、IL-6、IL-10、IL-11、IL-13、IL-1受体拮抗剂 (IL-1RA)和 TGF-β，可抑制炎症并抑制免疫细胞。一些细胞因子(例如 IL-6、IL-11、TGF-β)具有促炎和抗炎特性。
·单一细胞因子可能由不同细胞分泌，并且根据具体情况具有促炎或抗炎活性，从而产生多种免疫反应。促炎细胞因子和抗炎细胞因子之间动态且不断变化的平衡通过介导和调节炎症在宿主免疫系统中发挥着重要作用，促炎性细胞因子有助于自身免疫性炎症的引发和传播，而抗炎性细胞因子则有助于炎症的消退和自身免疫性疾病急性期的恢复。
·考虑到先天免疫和适应性免疫，促炎和抗炎细胞因子对免疫细胞分化、炎症、血管生成、肿瘤发生、神经生物学、病毒发病机制、动脉粥样硬化、癌症和衰老都具有重要的生物学和临床意义。
·表 2说明了与各种细胞因子相互作用相关的不同典型疾病，这支持了细胞因子作为多种自身免疫和炎症疾病的生物标志物的模型。
[影响生物体液中细胞因子定量的因素]
·血样处理对细胞因子稳定性的影响
o 已知大多数细胞因子在体内的半衰期很短(表 1)，并且在样品收集和制备过程中会快速降解，如果不采用适当的血液处理程序，这会导致假阴性信号。
o 血清和血浆源自全血，并在采血后进行不同的处理方式。血清是凝固血液的可溶部分，是血液凝固后获得。在凝块形成过程中，血细胞可能会被激活，细胞因子可能会从血小板释放到血清中(例如 IL-1、IL-6 和 IL-8)。
o 血浆是抗凝血液的可溶部分，在从全血中分离血浆之前，白细胞可以在体外分泌细胞因子并改变血浆中细胞因子的水平。为了获得血浆，在去除血细胞之前可以使用各种抗凝剂，例如乙二胺四乙酸(EDTA)和肝素锂/钠，从而抑制凝血和补体系统的激活。
o 研究表明，使用各种抗凝剂、内毒素管污染和血液处理(离心)延迟会对血浆或血清中的细胞因子浓度产生重大影响，并可能导致细胞因子测量值错误地增加或减少。例如，肝素(全血处理中的抗凝剂)可以诱导单核细胞释放细胞因子；肝素锂和柠檬酸钠被证明会影响 IL-6 和 TNF-α的水平，这可能归因于抗凝剂诱导的血细胞释放细胞因子，特别是在肝素血浆中，但在 EDTA 血浆中则不然。
o Friebe和Volk报道了血液样本中TNF-α 、IL-6和IL-8的稳定性，发现肝素血浆和血清中TNF-α和IL-8的水平增加，但它们在EDTA血浆中的浓度稳定。相比之下，所有血型的 IL-6 水平在 8 小时内保持稳定。与血浆中的细胞因子水平相比，血清中较高的细胞因子水平表明凝血过程促进了细胞因子的释放，这一结果与之前的研究结果一致。使用 EDTA 采集血浆似乎能带来最一致的结果，并且更接近于血清中获得的数据。总之，EDTA 血浆似乎最适合细胞因子测量，主要是出于稳定性原因。
o 此外，尽管血液采集和到达实验室进行测试之间总是存在时间间隔，但通常建议快速制备样品。
·样品储存对细胞因子稳定性的影响
o 为了获得可靠的结果，许多研究检查了储存对血液中细胞因子水平的影响。
o Cohen等评估了样品储存对血浆中 IL-6、IL-10、IFN-γ和 IL-2 测量的影响，全血在室温下储存会导致细胞因子水平降低，但全血在 4°C 下储存会导致细胞因子稳定性。
o Vincent等最近评估了血清冷冻前储存时间对细胞因子稳定性的影响，并将结果与从系统性红斑狼疮 (SLE) 患者获得的血浆样本进行了比较。在这项研究中，患者的血清和血浆样本在冷冻前预先在 4°C 下储存 0-30 天的预定时间，几乎所有分析的细胞因子(12 种中的 11 种)在冷冻前在 4°C 下保存长达 30 天时都是稳定的，只有单一分析物趋化因子(C-C 基序)配体 19 (CCL19) 从 4 °C 储存的第4天起显示出显著的信号衰减。与血浆相比，大多数分析物在未分离的血清中的细胞因子水平更稳定，但 IL-37 除外，它在血浆中似乎稍微更稳定，本研究建议未分离的血清样品在 4 °C 下最多可保存 3 天。
o Valaperti 等研究表明许多细胞因子在室温下采集样品后可以在短时间内保持稳定，建议快速处理和冷冻新鲜采集的全血样本，以避免假阳性结果。
o Panicker 等研究了在采集宫颈粘液时速冻和冷藏的效果，TNF-α、IFN-γ和 IL-1β在冷藏样品之间存在显著差异，显示每种细胞因子的水平较高，这一发现表明在收集后立即冷藏粘液样本可以更好地保存宫颈粘液中的细胞因子。
·冻融对细胞因子稳定性的影响
o Simpson等总结了样品在不同温度下储存或暴露于重复冻融循环时 33 种细胞因子的稳定性，由于通常使用预先解冻的样品，因此冻融稳定性评估是细胞因子测量的一个重要考虑因素。
o 经过多次冻融循环后，细胞因子的水平可以稳定、增加或减少，并且每种细胞因子的水平都不同。一般来说，大多数细胞因子在最多3次冻融循环中保持稳定。
o Jae 等评估了反复冷冻和解冻对不同细胞因子的血浆和血清浓度的影响，在反复冻融循环期间，血浆和血清中的 IFN-γ和 IL-8水平保持稳定。然而，某些细胞因子的浓度随着每个连续的冻融循环而变化，在三个循环后变得显著。
o Henno 等研究了冷冻和解冻对 EDTA 和柠檬酸盐血浆中细胞因子稳定性的影响，并报道血浆冷冻和解冻最多3次后细胞因子水平没有显著变化。然而，冷冻和解冻6次后，EDTA血浆中的 IL-1β水平出现轻微但具有生物学意义的下降，而 CCL5 水平则有所上升，这表明样品处理最多进行3次冻融循环，以便进行准确的细胞因子分析。
o 一般来说，为了保持细胞因子水平稳定以进行准确测量，样品应进行最小程度的冻融。
·可溶性细胞因子受体对细胞因子检测的拮抗和激动作用
o 可溶性细胞因子受体或细胞因子结合蛋白(例如 IL-18 binding protein，IL-18BP)由膜结合受体的蛋白水解裂解或由细胞释放，并出现在生物体液或组织培养上清液中的选择性剪接 mRNA 的翻译产生，这些受体作为竞争性抑制剂，在体外对其各自的细胞因子具有拮抗作用。
o 有许多例子说明大多数可溶性细胞因子受体可以干扰细胞表面受体并与细胞表面受体竞争游离细胞因子的结合，因此细胞因子受体阻止细胞因子结合其特定的膜受体并产生信号，从而抑制细胞因子活性。
o 可溶性细胞因子受体的拮抗作用可能在免疫反应的下调和某些细胞因子“过度活跃”的抑制中发挥重要作用。例如，Levine 报道可溶性 IL-1 受体可以通过优先结合 IL-1β 来减弱过度的 IL-1 生物活性。
o 尽管大多数可溶性细胞因子受体具有作为细胞因子的竞争性抑制剂的能力，但一些受体可能在体内增强其自身细胞因子的活性或具有与作为载体蛋白的附加作用一致的特性。
o 这种类型的可溶性受体通过与细胞因子的信号转导亚基相互作用来增强而不是抑制细胞因子的活性，从而产生信号(即可溶性 IL-6 受体 (sIL-6R) 和糖蛋白 130 (gp130))。与可溶性 IL-1 受体对 IL-1 信号的拮抗作用相反，Levine 报道了 sIL-6R 对 IL-6 信号放大的激动作用。因此，细胞因子与其可溶性受体的结合可以提高细胞因子的分子稳定性，从而导致活性降低。这一假设与生物活性 TNF三聚体与可溶性 TNF 受体的结合减缓其分解为无活性单体的观点一致，从而导致长期孵育后生物活性增加。
o 可溶性细胞因子受体的这些拮抗和激动作用可能会影响细胞因子的检测。一项研究表明，在某些情况下，例如炎症性疾病，生物体液中可溶性细胞因子受体的存在可能会干扰免疫测定，例如基于微珠的多重免疫测定和 ELISA。
o 几种细胞因子，特别是IL-1β、TNF-α和IL-6，可能与可溶性受体结合，形成免疫测定无法识别的结合形式。例如，在癌症患者中，竞争性免疫测定通常可检测到 TNF-α，但 ELISA 测定在癌症患者血浆中未检测到TNF-α，这与生物测定数据一致。Engelberts等研究了这些效应，并表明与 p55 TNF 受体结合的TNF-α不能被夹心 ELISA 测定很好地识别。
o 此外，就 IL-6 而言，血浆中含有几种结合形式的IL-6，分子量范围为50-150 至 400-500 kDa，与某些抗血清反应较差，并且由IL-6与可溶形式的IL-6 受体形成复合物，这引发了关于血浆中 IL-6 实际浓度的争议。大多数免疫测定发现正常血浆中IL-6的浓度无法检测到或范围在10-75 ng/L之间，在脓毒症中水平上升至1-2 µg/L，或者在脑膜炎球菌疾病中甚至是200 µg/L。
o 然而，May等报道大多数检测仅识别低分子量的 IL-6，使用识别高分子质量形式的单克隆抗体检测，在正常血浆中的 IL-6 浓度为 1-10 µg/L，并且在骨髓移植后患者的血清样本中，浓度为 5-10 mg/L。
o 因此，有必要确切地知道测定法正在测量细胞因子或细胞因子复合物的哪些成分，并且最好应考虑可溶性受体的水平。
[细胞因子检测技术]
·HTRF技术
o 均相时间分辨荧光(Homogeneous Time-Resolved Fluorescence, HTRF)技术采用夹心分析法检测，使用两种不同的特异性抗体，一种用Eu(供体)标记，另一种用d2(受体)标记。当标记的抗体与同一抗原结合时，供体用光源(激光或闪光灯)激发，触发向受体的荧光共振能量转移(FRET)，进而在特定波长(665nm)发出荧光。这两种抗体与样本中存在的T细胞因子结合，从而产生FRET。信号强度与形成的抗原-抗体复合物的数量成正比，因此也与检测的细胞因子浓度成正比。
o 实验仅需在空板中加入16μl检测样本，然后加入4μl检测抗体孵育2小时后即可使用酶标仪进行读数。
o HTRF技术检测细胞因子试剂盒体系中使用相同的buffer和低样本的需求，所以，实验允许从同一上清液中平行地定量多种细胞因子，可同时检测3个以上的细胞因子。仅需将样本加入孔板内，依次加入不同检测试剂即可实现不同细胞因子的检测。
·AlphaLISA技术
o AlphaLISA技术同样采用夹心法检测细胞因子，一个抗体被生物素化并与链霉亲和素包被的供体微珠结合，受体微珠则直接与另一个抗体结合。细胞因子存在的情况下，抗体与细胞因子结合使供体和受体微珠靠近，供体微珠的激发使得单线态氧扩散至受体微珠，从而发射615nm波长的光信号，AlphaLISA的检测信号与样本中存在的细胞因子的数量成正比。
o AlphaLISA技术是均相体系、操作方便、无洗涤步骤、2h完成检测；节省样本，样本需求低至5μl；体系稳定，批次间重复性高；灵敏度高，实验窗口大，线性范围宽；高通量，兼容96/384/1536孔板。
·放射免疫分析法 (RIA)
o 放射免疫分析法对生物样品中的细胞因子定量具有较高的敏感性和准确性，就像其他免疫测定法，RIA法需要先标记的细胞因子特异性抗体和/或标记的细胞因子或其受体与放射性同位素(主要是 I125) ，然后再进行检测。
o RIA的一个特殊优势是它对细胞因子的生物活性区域具有特异性，而不是对免疫活性区域的特异性，免疫活性区域可能很少或不参与细胞因子活性的表达。
o 但是，涉及使用放射性同位素的测定法大部分已被非放射性测定法所取代，因为考虑到辐射照射、劳动密集耗时的程序和昂贵的设备要求。
·DNA微阵列
o DNA芯片或微阵列的广泛应用允许在mRNA水平上同时分析来自不同组织或细胞的数千个基因的表达，该技术可用于确定表达细胞因子的基因在响应外部信号、细胞应激和各种病理条件时的上调。
o 微阵列是一种基于微杂交的检测方法，通过构建DNA微阵列，利用抗体-DNA与目标蛋白质的夹心免疫反应，产生邻位效应促使DNA杂交，进一步打开DNA微阵列上的捕获发卡DNA并引发杂交链反应，通过生物素-亲和素反应，使得大量辣根过氧化物酶(HRP)在DNA微阵列上结合，产生化学发光信号放大，实现多种蛋白质的同时、高灵敏图像检测。
·抗体芯片
o 抗体芯片是一种可靠而稳健的方法，用于从复杂蛋白质组中提取多重数据，具有高灵敏度、高特异性和高通量。第一个抗体芯片是由Chang于1983年开发的，在1cm2面积的玻璃盖玻片上发现了10×10和20×20网格中的抗体。
o 当前抗体芯片多用三明治夹心或直接标记，使用化学发光或者荧光进行检测。三明治夹心抗体芯片使用抗体对，必须验证和检查与阵列中所有其他抗原/抗体的交叉反应性。
o 出于这个原因，芯片一般涵盖10-80个分析指标，通过组合多个阵列，可以检测和定量人体样品中多达1000种分泌的人类蛋白质，如细胞因子、趋化因子、脂肪因子、生长因子、蛋白酶、可溶性受体和其他蛋白质。此外，小鼠、大鼠、牛、羊等不同种属的芯片，也正在开发中。
·单分子技术
o单分子计数(Single Molecule Counting, SMC)技术最初由Singulex公司开发，将基于磁珠的免疫测定与单分子计数检测相结合。
o 经典的 96 孔板中，基于磁珠的免疫测定法用于形成夹心复合物(捕获抗体-抗原-荧光标记的检测抗体包被的磁珠)。然后，破坏夹心复合物，并使用专有的数字SMC技术分析洗脱的荧光标记检测抗体，使用激光共聚焦显微镜数字计数器对单分子荧光信号(“闪光”)进行计数。
o SMC 检测试剂盒可检测人体样品中的细胞因子，灵敏度为sub-pg/mL。
·免疫PCR技术
o 免疫PCR最初描述于1992年，结合免疫测定的高特异性和聚合酶链反应(PCR)的高灵敏度。与传统ELISA中底物和产物之间的线性关系相比，免疫PCR可实现信号指数级放大，灵敏度比普通ELISA高1000倍。
o 夹心形式的免疫PCR，与夹心ELISA相同，在捕获抗体包被的96孔板中进行。与 ELISA 测定中用于检测的酶抗体偶联物不同，免疫 PCR利用与 DNA 共价偶联并通过定量 PCR 检测的检测抗体。
o 虽然免疫PCR的优点是显而易见的(例如，超灵敏、良好的重现性和普遍性)，但其主要局限性是背景高且需要大量的洗涤步骤。
·者邻近连接技术
o 者邻近连接测定(Proximity ligation assay, PLA)最初由Fredriksson等开发，使用对血小板衍生生长因子(PDGF)具有亲和力的DNA适配体来量化PGDF。
o 同源二聚体PDGF-BB可以容纳两个适配体分子，每个分子都具有引物结合的延伸和额外的延伸，在杂交到共同的连接器寡核苷酸时进行连接。
o PCR产物的实时检测可检测到低至10-20 pmol浓度的细胞因子/蛋白。
·免疫磁减量检测
o 2006年首次描述了磁减量生物分析技术，目前的免疫磁减量(Immunomagnetic reduction, IMR)测定，将捕获抗体固定在磁性纳米颗粒，这种纳米颗粒均匀分散在溶液中，并通过施加外部多个磁场(即易受磁场影响)而振荡。加入分析样品后，由于抗体捕获分析物分子，纳米颗粒变得更重，导致纳米粒子对磁场的响应降低，降低程度对应于样品中存在的目标分子的量，能够检测pg/mL浓度的细胞因子/蛋白。
o IMR测定的主要优点是它是一种简单的技术，不需要洗涤步骤即可去除未结合的试剂，具有高度的灵敏度和定量性。例如，淀粉样蛋白-β1-42和α-突触核蛋白的浓度范围分别为1-50000 pg/mL和0.3 fg/mL-300 pg/mL。
o 与夹心免疫测定不同，IMR测定仅使用一种抗体(“捕获”抗体)，测定特异性通过纳米颗粒的振荡运动来确保，其中微弱的非特异性抗原-抗体相互作用由于施加磁场在纳米颗粒上引起的离心力而被破坏。
o IMR测定目前旨在识别疾病的早期阶段，例如神经退行性疾病、癌症和病毒感染。
图1. 免疫磁减量(IMR)检测原理
(A)每个磁性纳米粒，具有针对目标蛋白的抗体的生物功能，在与ICP11结合之前，在施加的交流电(AC)磁场下振荡。χac,0：磁性纳米粒的原始多频交流磁化率。(B)当这些磁性纳米粒与靶蛋白结合时，它们变得更大，有些甚至形成簇状，这降低了试剂的交流磁化率。χac,φ：磁性纳米粒与靶蛋白结合后的磁化率。
·微流体技术
o Usuba 等制造了一个具有微流体结构的光子芯片(Photonic lab-on-a-chip, PhLoC)，用于快速检测 IL-2。
o PhLoC包括光学元件、测量室、空气旁路和其他用于引入和冲洗溶液的流道，流道仅能够将溶液引入测量室并改善抗体在测量室表面上的固定，淋巴细胞分泌的 IL-2 可在 15 min内测量，浓度范围为 50-1000 pg/mL。
o 在芯片实验室设备中，微流控技术为实现更快速、更高效的体外检测提供了有效的解决方案，因为1)微流控通道具有较大的表面积与体积比，加速了抗原抗体反应；2)微流控技术平台最大限度地减少了昂贵试剂和珍贵样品的消耗；3)可以通过将多个传感器集成到通道中来实现多重分析。
图2. 不同类型的微流控法检测细胞因子原理图
A)具有集成光学和微流体组件的 PhLoC 示意图；B) 测定初始阶段单位细胞流体排列的 3D 图形表示；C) 测定第二阶段期间单元电池流体布置的 3D 图形表示，详细说明了 Proxim 手持式仪器的测定区域和电化学传感器测试盒之间的流体端口和连接。
·质谱细胞术
o 质谱细胞术是将流式细胞术和元素质谱技术两个实验平台相结合的一种新技术，已经越来越多地用于快速分析单个细胞，这种分析使得能够在单个细胞分辨率下测量超过40个细胞参数，显著促进了生物活性分子对细胞群体的高维、定量分析，从而增强了细胞学评估复杂细胞系统和过程的能力。
o 质谱细胞术利用了稀土金属同位素作为与抗体结合的标记，而不是荧光物质。由于具有离散读数的特性，质谱细胞术中同位素作为报告物质的使用增加了每个细胞可测量的参数数量。此外，该平台具有数量上的准确性，其灵敏度在四个数量级上是线性的。因此，高维质谱细胞术能够以单细胞粒度同时、高灵敏度地测量来自先天和适应性免疫细胞亚群的多种细胞因子。
o Baxter等开发了一种全面的质谱细胞术分析方法，用于单次分析外周全血中的免疫表型和细胞因子产生，这种单细胞蛋白质组学方法使得能够同时评估多种免疫细胞类型，并在患者特异性的“病原性”外周血液环境中检测到各种细胞因子的变化。通过质谱细胞术分析外周血，还可以确定特定患者异常调节的细胞亚群及其异常的细胞因子产生，这使得治疗方案的个性化成为可能。因此，可以在体外测试特定的治疗选择，以评估其免疫调节的有效性。
o 该技术也存在一些限制，包括对每个探针需求严格的金属同位素(没有前向或侧向散射的等效物)以及破坏性(没有排序细胞恢复的可能性)，当前质谱细胞仪的配置也具有有限的细胞透过率，因此需要更多的输入细胞数量。
·基于荧光的细胞因子生物传感器
o 荧光生物传感器是一种基于与靶分子相互作用导致荧光特性发生变化的检测方法，它广泛用于分析传感和光学成像。
o 当靶分子被其受体识别时，荧光信号(如荧光强度、发射波长和荧光寿命)可以通过不同机制(电子转移(eT)、电荷转移(CT)或能量转移(ET)过程)以猝灭、增强或荧光最大值移位的形式被观察到。
o 由于其高灵敏度、快速响应时间、技术简易性、多种染料选择用于多重检测以及能够以廉价的方式实现现场和实时检测等特点，荧光免疫分析已成为定性和定量检测细胞因子的最广泛应用方法之一。
o Rahimian等报道了一种微囊化荧光免疫分析，用于检测经最少处理的血液中的IFN-𝛾和TNF-𝛼，检测限为分别为14.8×10-12M和14.4×10-12 M。白细胞分泌的细胞因子扩散到微囊的核心，并被核心中的修饰抗体的珠子捕获，目标分子通过与二级荧光标记抗体染色来检测。封装的微珠的荧光强度与其在血液中的浓度相关，这种封装的免疫分析代表了在血液等高度复杂环境中保持感测元件操作的一种有前途的策略。
o 为了通过在细胞膜上应用捕获技术来检测单个细胞的细胞因子分泌，提出了细胞表面ELISA(OnELISA)的配置。这已经用于鉴定和筛选高细胞因子分泌细胞，利用商业可获得的标记有dragon green 荧光的磁珠，OnELISA是一种夹心免疫传感器，能够在单细胞水平(0.1 pg/mL)检测IL-6。这些细胞表面生物传感器为识别和筛选高细胞因子分泌提供了有前途的方法，用于再生医学应用。
o 在细胞内细胞因子检测方面，荧光生物传感器已被应用。例如，一种基于石墨烯量子点(GQDs)的简单而敏感的“开关式”纳米传感器已经被开发用于检测IFN-𝛾的细胞内存在，具有2 pg/mL的灵敏度。聚集GQDs的自熄灭会关闭荧光，而由于靶分子IFN-𝛾的存在引起的GQDs的解聚会导致与IFN-𝛾浓度成正比的荧光恢复。这些荧光纳米传感器已成功用于活PBMC和BV2细胞中的细胞内IFN-𝛾的检测作为基本模型，并且可以作为针对一系列细胞内细胞因子的通用开启传感探针。
o 利用聚集诱导发光剂的性质，报道了一种用于测量由活细胞分泌的细胞内IFN-𝛾的荧光适配体传感器，其在体外条件下的低检测限为2 pg/mL。这种适配体传感器由显示强红色发射的荧光素(TPEN3)和具有高亲和力的IFN-𝛾的寡核苷酸组成，探针能够在低浓度下定位细胞内IFN-𝛾，并且成功用于实时成像，表现出优良的细胞透过性和生物相容性以及低毒性。
o 荧光基生物传感器具有灵敏度高、响应速度快、非破坏性和实时检测等优点。然而，使用基于荧光的光学生物传感器的主要缺点是背景干扰和样品标记需要荧光试剂，这增加了操作的时间和成本。
图3. 基于荧光的细胞因子生物传感器
A)微胶囊感测的示意图；B)磁性荧光纳米颗粒被细胞生物素化表面上的抗体捕获的试验；C)用于在单细胞水平上测量细胞因子分泌的T细胞表面寡核苷酸传感器的示意图；D)利用由CHA激活的三种靶标响应性脂质体的荧光法检测IFN-𝛾的示意图。
·基于SPR的细胞因子生物传感器
o 表面等离子共振(Surface Plasmon Resonance, SPR)广泛应用于临床分析中，因其提供了一种无标记且实时的方式来测量生物分子间的相互作用。
o 在SPR系统中，分析物被生物分子识别元素捕获在SPR生物传感器的金属表面上，改变了金属表面的折射率，折射率的变化可以通过不同的光学手段(如强度调制、角度调制、波长调制、相位调制，甚至偏振调制)进行精确测量。
o 作为一个优点，可以通过测量共振谷的光谱偏移来连续监测分析物的浓度，而无需额外的标记。由于其高灵敏度和能够实时进行无标记测量，基于SPR的生物传感器已成功应用于疾病诊断中的细胞因子测量。
o Wu等报道了一种用于实时监测人CD4+ T细胞捕获和它们动态产生IFN-𝛾的无标记SPR生物传感器，从而能够以高灵敏度(85.5%)和特异性(97.7%)诊断结核病(TB)的临床样本。CD4 + T细胞被抗CD4抗体捕获，含有TB特异蛋白的培养基被注入以刺激捕获的CD4 + T细胞释放IFN-𝛾。当添加TB特异蛋白时，SPR信号实时监测，允许对CD4 +细胞分泌的IFN-𝛾蛋白进行定量。
o Liu等制备了一种局部表面等离子共振(LSPR)免疫分析用于检测刺激的巨噬细胞分泌的细胞因子(IL-6和TNF-𝛼)，利用电子束光刻和海藻糖聚合物直接在硅衬底上载入抗体。这种夹心免疫分析可通过暗场显微镜进行可视化，利用银增强金纳米粒子次级抗体的表面等离子共振，成功地展示了在单个芯片上对IL-6和TNF-𝛼的多重测量，具有很高的特异性和灵敏度(TNF-𝛼为5 pg/mL，IL-6为50 pg/mL)，这种直接制备用于细胞因子检测的捕获抗体图案的方法对于生物传感应用具有潜在价值。
o Chen等开发了一种无标记、多阵列局部表面等离子共振(LSPR)光学生物传感器芯片，用于大规模并行高通量检测多种细胞因子(IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IFN-𝛾、TNF-𝛼)。该器件采用易于实现的一步微流体图案化和金纳米棒(AuNRs)的抗体偶联来制备，纳米棒微阵列制备是通过一步微流体图案化技术完成的，该技术利用了纳米棒与基底表面之间的静电吸引相互作用。随后，这些纳米棒微阵列被集成在一个具有8个并行微流体检测通道的微流体芯片中，包括用于试剂加载和清洗的入口和出口端口。特定抗体通过硫化交联剂和EDC/NHC化学反应与图案化的AuNR微阵列结合。目前的芯片设计集成了480个AuNR微阵列传感器点，制备的LSPR微阵列芯片然后在暗场显微镜和扫描电子显微镜(SEM)下成像，这种LSPR生物传感技术允许从1μL血清样品中对浓度为5-20 pg/mL的细胞因子进行高灵敏度的定量测量。
o Zhu等报道了细胞捕获和基于LSPR技术的金帽纳米柱结构环氧乙烯共聚物(COP)薄膜的简单协同集成，用于IL-6的检测，灵敏度为190.2 nm/RIU，检测限为10 ng/mL。在这项研究中，新鲜培养的IL-6过表达Jurkat细胞被用于评估这种基于LSPR的生物传感器的灵敏度和能力，培养的细胞直接被厚的COP细胞捕获芯片捕获，并开始释放IL-6，IL-6将立即与纳米柱状LSPR检测薄膜表面的抗体结合而无需刺激。制备的装置显示了实时监测细胞因子的潜力，这将允许我们识别受测单个细胞的生存能力和生物变异。
o 虽然SPR在蛋白质检测方面有着广泛的应用，但SPR传感器普遍面临的一个常见挑战是传感器上产生的非特异性结合事件产生的信号问题，这是一个需要通过应用防污策略进行更多研究的问题。
图4. 基于表面等离子共振的细胞因子生物传感器
A)CD4+ T细胞捕获和IFN-γ释放的实时监测的示意图。B)用于多重细胞因子检测的直接蛋白图案的示意图C)LSPR微阵列芯片的示意图D)集成的局部表面等离子共振(LSPR)细胞因子检测的示意图。
·基于SERS的细胞因子传感器
o 表面增强拉曼光谱(Surface Enhanced Raman Spectroscopy, SERS)已成为一种强大的振动光谱技术，通过放大由局部表面等离子体激发产生的电磁场，可以对低浓度分析物进行高灵敏度的检测。
o 基于SERS的生物传感器作为一种流行且有前景的方法，由于其高灵敏度、高特异性和多通道非破坏性检测能力等优点，已被广泛用于细胞因子的快速和定量测量。
o Lai等利用磁珠pull-down法结合SERS进行了TNF-𝛼的快速敏感检测，稳定、单分散且高灵敏的SERS标记由纯化的包埋在二氧化硅中的小金纳米颗粒团聚体制备而成，二氧化硅的包埋提高了SERS标记的稳定性，使信号重复性好，并为后续的生物偶联提供了坚固的表面，具有高特异性、选择性和对TNF-𝛼浓度的灵敏度可达1 pg/mL。通过识别胶体混合物中多达三种不同拉曼报告物的特征拉曼峰和条形码信号，显示了这些SERS标记作为灵敏报告物在多通道生物分析应用中的巨大潜力。
o Kaminska等开发了一种基于硅藻生物硅质为免疫基质、以DTNB(即5,5'-二硫代二硝基苯酸)为拉曼报告物的SERS免疫分析方法，用于血浆中IL-8的检测。这些带有DTNB标记的免疫性金纳米颗粒可以与生物硅质材料上固定的IL-8抗原和抗体形成夹心结构，建立的SERS免疫分析法具有较低的检测限(6.2 pg/mL)，为临床环境中细胞因子的超灵敏和高特异性检测提供了宝贵的平台。
o 为了对多种细胞因子进行敏感和同时检测，Li等开发了由金核、拉曼报告细胞和银壳组成的SERS纳米标记，用于敏感和多通道识别从淋巴瘤细胞分泌的细胞因子(IFN-𝛾、TNF-𝛼和IL-10)，该SERS免疫分析法显示出较高的灵敏度(4.5 pg/mL)和良好的特异性。更重要的是，与许多传统方法相比，这种夹心免疫分析策略的响应速度更快，因为它具有多通道功能，而其检测限和准确性与标准的ELISA法相当。
o 在另一项与动脉粥样硬化(AS)相关的疾病诊断工作中，报道了一种基于纸张的SERS分析法，用于敏感的双重细胞因子(IL-10和MCP-1)检测，该SERS生物传感器结合了一种利用聚丙烯(PP)基底和聚四氟乙烯(PTFE)涂层制成的聚合物膜的纳米多孔网络膜作为基底，以及SERS纳米标记作为信号检测探针以及夹心设计，它表现出对人血清中细胞因子目标的灵敏和特异性识别和定量测量的优秀感测特性。在这项工作中，增加的表面积提供了高载量的捕获抗体，从而增强了灵敏度。由于夹心设计中的两层金纳米颗粒的独特特点，产生了金纳米颗粒之间的小间隙；这产生了“热点”效应，可以增强SERS信号，从而实现了低检测限(0.1 pg/mL)的高灵敏度检测。因此，基于纸张的SERS分析平台可以潜在地用于细胞因子的检测，甚至作为商业单位，并且在复杂环境中进行多通道目标分析具有巨大潜力。
图5. 基于表面增强拉曼光谱的细胞因子传感器
A)用于检测淋巴瘤分泌的细胞因子的多重SERS纳米标记的示意图；B)用于检测淋巴瘤分泌的细胞因子的多重SERS纳米标记；C)用于检测淋巴瘤分泌的细胞因子的多重SERS纳米标记；D)基于纸基底的 MCP-1 和 IL-10 双重检测的检测方法工作流程图。
·基于电化学的细胞因子生物传感器
o 电化学转换作为一种生物传感技术非常受欢迎，与其他方法相比，电化学技术具有自身的优势，如低成本，在安培计量中特别具有高灵敏度，并且便于设备微型化。电信号的输出可以是阻抗、电流和电压，许多电化学生物传感器已经被开发用于细胞因子的检测。
o Filik等总结了近期针对TNF-𝛼测定的多种电化学测定法的发展，展示了各种新颖的感应策略，用于改进免疫电化学传感器以选择性地检测细胞因子。Sanchez-Tirado等报道了一种简单而灵敏的安培计量免疫传感测定法，利用植入电化学支架的出色性能，用于唾液中IFN-𝛾的共价固定生物分子的检测。图6A显示了这种电化学免疫传感器的制备步骤以及安培计量检测中涉及的反应。屏印碳电极(SPCE)通过循环伏安法将对氨基苯甲酸偶氮盐接枝到电极表面(步骤1)以共价固定捕获抗体(步骤2)，剩余的自由活性位点用BSA阻断(步骤3)。在捕获IFN-𝛾后，使用生物素-抗IFN和过氧化物酶标记的链霉亲和素进行夹心型免疫分析(步骤4)。通过在氢醌(HQ)存在下向电极表面添加过氧化氢溶液(步骤5)进行安培计量测定，获得了1.6 pg/mL的低检测限，用于IFN-𝛾的定量。这种电化学免疫传感器所展示的分析性能，包括可丢弃性和使用袖珍式电化学仪器的可能性，使其具有吸引力，用于开发用于现场测量唾液中IFN-𝛾的POC系统。另一项发展是基于氧化石墨烯(GO)薄膜修饰的电化学纳米夹心装置，用于IL-6的检测。
o 为了通过电化学测定实现多种细胞因子的测量，Shen等制造了无标记的电化学生物传感器，用于帕金森病小鼠模型中多种细胞因子的体内检测。Wei等还开发了一种电化学免疫传感器，用于同时检测三种细胞因子IL-6、IL-1𝛽和TNF-𝛼。玻璃碳(GC)表面被功能化，将4-羧基苯和4-氨基苯磷酸胆碱(PPC)的混合层附着为感测界面，用于固定IL-6、IL-1𝛽和TNF-𝛼的捕获单克隆抗体。捕获IL-6、IL-1𝛽和TNF-𝛼后，引入载有氧化还原探针(尼罗蓝(NB)、亚甲基蓝(MB)或二茂铁(Fc))和特定细胞因子的抗体的GO。通过监测信号报告物的电化学信号的变化实现对细胞因子的定量检测。该系统成功地用于同时检测，表现出良好的灵敏度、选择性、稳定性和恢复性能。Sanchez-Tirado等人开发了一种双壁碳纳米管功能化的双SPCE，用于血清和唾液中IL-1𝛽和TNF-𝛼的同时检测。图6B显示了双电化学免疫传感器的制备方案。在每个双SPCE表面滴加Mix&GO后，固定了IL-1𝛽和TNF-𝛼的抗体，然后通过BSA阻断电极表面上剩余的活性自由位点。然后，通过将目标细胞因子和生物素化的检测抗体组合来实现夹心型分析。进一步通过聚-HRP-Strept共轭实现过氧化氢作为HRP底物和HQ作为氧化还原介质的IL-1𝛽和TNF-𝛼的安培计量确定。
o 对于免疫传感器，基于结构转换的适配体的电化学生物传感器也可以实现实时细胞因子的检测。特别是，为了提高基于适配体的细胞因子生物传感的灵敏度和稳健性，表面纳米制造和比率测量是重要的。Liu等开发了一种基于外切酶介导的表面启动酶聚合(SIEP)结合[Ru(NH3)6]3+用于IFN-𝛾检测的适配体基电化学免疫传感器。首先，电极表面被金纳米颗粒-石墨烯纳米复合材料(Au-Gra)功能化。然后，在修饰的电极表面上固定了杂交的双链DNA(dsDNA)，然后通过己烷硫醇溶液(HT)阻断了非特异性位点。添加IFN-𝛾后，适配体从dsDNA中被释放出来，并被RecJf外切酶选择性地消化，使IFN-𝛾释放用于目标回收。然后，在循环过程中形成了大量的单链捕获探针。随后，在电极表面的单链捕获探针上捕获了大量的信号探针标记的Au@Fe3O4(SP-Au@Fe3O4)。最后，通过端尾脱氧核苷酸转移酶(TdT)介导的级联延伸，形成了长链ssDNA结构，以[Ru(NH3)6]3+的静电吸附来产生电化学信号。该提议的适配体传感器显示了0.003 ng/mL的低检测限，为IFN-𝛾和其他细胞因子的可靠检测提供了简单、灵敏和强大的工具。此外，该传感器具有临床诊断、传染病监测和现场测试的潜力。
o Ni等开发了一种稳健的适配体传感器，通过修饰亚甲基蓝负载的石墨烯氧化物(GO/MB)和铁素标记的适配体到GC电极上，实现了在血清中VEGF的双电化学信号模式比率定量测定，具有更宽的线性范围(10-5×102pg/mL)和更好的灵敏度(10 pg/mL)。
o Liu等展示了基于大型纳米结构表面的适配体基电化学生物传感器对细胞分泌的细胞因子的更敏感分析，通过改进的运输和增强的单位面积表面积。利用覆盖有金的硅纳米线(Si NWs)作为工作电极，实现了IFN-𝛾的适配体基检测，适配体分子被设计成形成发夹结构，而氧化还原报告物质甲基蓝与电极表面距离较近，IFN-𝛾的结合导致氧化还原标签离电极进一步移动，改变了发夹的构象，并抑制了来自氧化还原报告物质的电子转移，降低了电化学氧化还原信号。使用方波伏安法量化了IFN-𝛾结合前后的法拉第电流的差异。
o 图6D显示了悬浮细胞和平面Au电极以及AuNWs电极上的细胞沉积和细胞因子IFN-𝛾分泌的不同行为。一系列实验表明，与标准平面电极相比，NW适配体传感器对IFN-𝛾的响应更快、更敏感，允许使用低检测限(0.14 ng/mL)测量IFN-𝛾。该NW适配体传感器具有更大的表面积和更高的适配体包装密度，并且受到直接白细胞沉积的影响较小。它在细胞因子检测方面具有巨大潜力，并满足了对疾病敏感诊断的重要需求。
图6. 基于电化学的细胞因子生物传感器
A)用于测定IFN-𝛾的电化学免疫传感器制备步骤的示意图；B)用于多重确定IL-1𝛽和TNF-𝛼的双重电化学免疫传感器制备步骤的示意图；C)基于外切酶催化的靶分子回收和表面启动酶聚合的逐步Aptasensor制备示意图；D)基于Aptamer的IFN-𝛾电化学传感器。
·其他类型的细胞因子生物传感器
o CRISPR/Cas(聚集的规律间隔短回文重复序列/CRISPR相关蛋白)生物传感是一种高灵敏度和选择性的工具，可用于检测不同的目标，包括细胞因子。除了Cas9和Cas12因子外，最近发现的Cas13a效应子的背景RNA裂解活性引起了更大的关注，以开发用于核酸检测的新型生物传感技术。CRISPR/Cas13a还使得开发具有高灵敏度的直接RNA测定方法成为可能，用于细胞因子检测。
o Chen等报告了一种CRISPR/Cas13a信号放大联合免疫吸附测定法(CLISA)，用于IL-6和VEGF的检测，该测定法通过T7 RNA聚合酶转录和CRISPR/Cas13a的背景裂解活性使输出信号进行了双重放大，T7聚合酶可以识别启动子序列进行转录，并产生许多单链RNA分子。CRISPR/Cas13a系统能够准确识别转录的RNA分子，导致激活CRISPR/Cas13的跨切活性，系统中带有荧光团和猝灭剂团的短单链RNA报告物可以通过跨切活性被切割，生成荧光信号。这种CRISPR/Cas13a生物传感具有很高的灵敏度，并且对细胞因子测量的检测限可达到飞秒摩尔水平，可以快速同时对大量样本进行筛选，为生物传感、医学研究和分子诊断提供了潜在的超灵敏检测方法。
o 基于颜色变化的比色传感器因其固有的优势(如简单处理和视觉指示)而引起关注，可用于各种分析物的即时检测。贵金属纳米颗粒的光学性质在其与分析物相互作用时会引起可见颜色变化，这是因为纳米颗粒的分散和聚集。因此，贵金属纳米颗粒在比色传感中具有生物分子检测的潜力。金纳米颗粒(AuNPs)是用于细胞因子检测的比色分析中最受欢迎的贵金属实体之一。例如，Zhang等报道了一种基于寡核苷酸的比色生物传感器，利用AuNPs结合支链DNA扩增策略来定量VEGF，这是血管生成和血管通透性的重要细胞因子。使用这种比色生物传感器，可以在一个小时内检测到3.7飞摩尔的VEGF。Wu等提出了一种基于目标触发的Aptazyme与AuNPs结合的VEGF测量的比色传感器。如图7B所示，这种测定法设计了一个包含VEGF适配体(黑色)、DNA酶(紫色)和短干扰序列(黄色)的Aptazyme。此外，设计了一个链接物，其中包含AuNPs的交联序列和DNA酶的底物序列。在存在VEGF的情况下，VEGF与其适配体之间的识别引起Aptazyme的构象变化，从而激活DNA酶。由于AuNPs无法交联，AuNPs溶液的颜色保持为红色，在目标蛋白质缺失时，颜色会发生变化。基于颜色的变化，开发了一种简单、快速和经济有效的方法，用于VEGF的定量测定，检测限低至0.1×10-9M。
o 基于微环共振器(MR)的传感，基于准确测量接收层折射率的变化，用于目标和抗体修饰的微环之间的表面结合的实时检测，已经在标签自由和实时生物分子检测中找到了许多应用。这种基于MR的传感器的优点包括高机械稳定性、检测灵敏度、可扩展到传感器网络的可扩展性以及由于硅片尺寸加工而降低的成本。因此，这种方法代表了一种有前途的平台，用于细胞因子的实时检测。硅光子微环谐振器，一类高Q光学微腔，由于实时反应监测能力、小尺寸上的高可扩展性、每个器件低成本和易于制造，最近显示出在细胞因子的无标签生物分析中具有潜力。例如，Kindt等报道了一个集成了酶信号增强方案的多重可扩展硅光子MR平台，用于在未稀释的脑脊液中同时定量IL-2、IL-6和IL-8，提供了1 pg/m或以下的检测限，基于MR的传感平台在超低浓度下对多种细胞因子的多重检测具有重要潜力。此外，硅光子MR平台结合夹心免疫测定法可以实现多种细胞因子的实时监测，Luchansky和Bailey利用一个固有可扩展的硅光子MR分析平台，在仅5min的测定中实现了来自原代人类T细胞群体分泌的四种细胞因子(IL-2、IL-4、IL-5和TNF-𝛼)的同时检测。总之，基于MR的生物传感器是一种有前景的平台，可用于多种多重和实时体外诊断应用，并应进一步进行研究。
o 干涉反射成像传感器(IRIS)是另一种用于细胞因子的无标记和实时检测的潜在技术，在这种生物传感过程中，传导基于光谱反射率。随着上层的整体厚度增加，由于生物质在分层基板表面的积累，上层表面与覆盖有二氧化硅(Si-SiO2)界面层的硅基板之间的光学路径差(OPD)也增加，导致光谱反射率发生可量化的变化。因此，这种功能性平台允许对表面结合的生物分子进行准确、无标记和动态的监测。IRIS技术的实用性已经在细胞培养基中IL-6的实时测量中得到了证明，无标记的生物传感器使得对IL-6的检测信号提高了7倍以上，其检测限接近2 ng/mL。因此，IRIS可用作体外免疫反应的分析平台或用于监测疾病进展。
图7. 其他类型的细胞因子生物传感器
A) CRISPR/Cas13a信号放大系统的示意图；B) 利用VEGF作为示例的蛋白质检测的提出方法。
[细胞因子检测技术的比较]
4种细胞因子检测方法比较
| 检测技术 | ELISA | CBA | Luminex | HTRF |
| 检测指标 | 单指标检测 | 多指标检测 | 多指标检测 | 单指标检测 |
| 检测对象 | 组织培养上清、血清、血浆等 | 组织培养上清、血清、血浆等 | 组织培养上清、血清、血浆等 | 细胞培养上清 |
| 样品用量 | 100-200 ul | 15-50 ul | 25-50 ul | 10-20 ul |
| 实验时间 | >24 h | 3.5 h | 3 h | 2 h |
| 样本分析 | 酶标仪测OD值
根据标准曲线计算出样本含量 | 流式细胞仪检测
FolwJo软件分析 | Luminex仪器检测
Luminex xPONENT软件分析 | 荧光酶标仪检测
Graphpad四参数拟合 |
| 结果分析 | 绝对定量 | 相对定量 | 绝对定量 | 绝对定量 |
参考文献
1. https://www.xjishu.com/zhuanli/52/201810429351.html
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