BioMolly 细胞奇遇记 2024-05-13 21:45 上海
Fluorescence in situ hybridization
荧光原位杂交技术（Fluorescence in situ hybridization, FISH）是通过荧光素标记的DNA探针与样本细胞核内的DNA靶序列杂交，从而获得细胞核内染色体或基因状态的信息。FISH的出现代表了细胞遗传学领域的重要一步，现已被广泛用于研究和诊断。FISH相对于其他原位杂交方法（放射性或免疫细胞化学）的优势主要是由于显著提高了速度和空间分辨率。除此之外，标记的探针是稳定的，可以长期储存，并且不再需要中期染色体上非特异性信号的统计分析。
· 根据标记方式分为直接标记探针和间接标记探针
（1）间接标记型探针是指DNA探针先与某个半抗原连接，然后半抗原与荧光素基团连接从而形成探针-半抗原-荧光素基团的复合物。
生物素（biotin）、地高辛（digoxigenin）、二硝基苯酚（DNP）等均可用于探针标记。前两者较为常用，通常采用切口平移法或随机引物法对探针进行标记。如两个不同的探针分别用生物素和地高辛标记，杂交后用不同的半抗原分别同两种探针结合，应用双色滤光片，在显微镜下就能同时看到发出的两种不同色荧光。同理，采用更多种半抗原进行不同排列组合，可同时测得多种不同颜色的荧光信号。
（2）直接标记型探针是指DNA探针共价结合荧光基团。一些大片段的DNA探针（100-400kb）由于长度足够长，可以将荧光物质直接标记在核苷酸上，不仅使杂交过程进一步简化，而且杂交信号更强。
与间接标记型探针相比，直接标记型探针具有低背景、高特异性的优点。随着荧光染料和荧光检测技术的不断发展，直接标记型探针的灵敏度也不断提高，因而在FISH检测领域，尤其是疾病分型领域，探针大多采用直接标记型来设计。
· 根据探针用途分为计数探针和结构探针
（1）计数探针：标记某条染色体或某个基因的特异性片段，染色后直接观察标记基因颜色进行计数确定数值或者平均拷贝数，根据不同探针说明书要求进行判断，有些需要先看比值再看拷贝数，而有些则直接看比值即可。
（2）结构探针：标记的基因能涉及到染色体结构变化的探针。染色后观察时先要明确异常信号的模式，然后再计数各种异常信号的细胞个数占观察区域总体细胞的比例，再比对判读标准进行判断。
1）二甲苯脱蜡三次，每次5 min；
2）100%酒精两次，每次2 min；
3）移出酒精，斜置切片，标记末段向下，空气干燥。
1）每个染色缸加入40 mL蛋白酶K消化溶液：2×SSC 40 mL置于离心管中水槽预热到37℃，消化酶加入管内，温和摇动直到酶溶解。
2）37℃水浴预热染色缸和蛋白酶K溶液，孵育切片20min；
3）2×SSC在室温下漂洗切片3次，每次1 min；
4）-20℃预冷的梯度酒精脱水。
1）染缸内加入40 mL变性溶液；
2）78℃水浴槽中平衡预热混合液染色缸；
3）78℃孵育8 min；
4）立即移入-20℃预冷70%酒精的染色缸内2 min，再依次移入80%、90%和100%的-20℃预冷酒精内，每次2 min；
5）空气干燥。
1）准备探针；
2）取一个较大的湿盒，交叉放置切片；
3）滴10 μL探针在切片的组织上，加盖玻片；
4）盖上湿盒盖，37℃孵育12-16h；
5）镊子小心去除盖玻片；
6）43℃预热杂交后水洗溶液40 mL水洗切片15 min；
7）2×SSC 37℃洗两次，每次10 min；
8）切片放入染色缸的1×PBS内待检测，保持切片湿润。
9）从1×PBS中取出切片，除去过多的水分，避免标本干燥。把切片移入湿盒内；
10）每张切片使用30-60 μL罗丹明抗地高辛抗体或FITC卵白素，室温下孵育20 min；
11）去掉塑料盖膜，把切片放入含1×PBS的染色缸洗去抗体。清洗3次，每次2 min；
12）从染色缸中取出切片，斜置切片使表面PBS流下；
13）每张切片使用30-60 μL抗卵白素抗体，加塑料盖膜，室温下孵育20 min；
14）去掉塑料盖膜，把切片放入含1×PBS的染色缸洗去抗体。清洗3次，每次2 min；
15）从染色缸中取出切片，斜置切片使表面PBS流下。
1）每张切片加10-20 μL DAPI，覆盖盖玻片并在室温下孵育2-5 min；
2）尽可能快地在荧光显微镜下观察或封闭盒内保存在-20℃冰箱。切片在染色后1h内可以在显微镜下观察。
· 优点
1）安全、快速、灵敏度高；
2）探针能较长时间保存；
3）多色标记，简单直观；
4）可用于中期染色体及间期细胞分析；
5）可用于新鲜、冷冻或石蜡包埋标本及穿刺物和脱落细胞等多种物质的检测。
· 缺点
1）不能达到100%杂交，特别是在应用较短的cDNA探针时效率明显下降；
2）没办法准确判断断裂基因的具体坐标位置，进一步判断需要RNA-seq来进行。
目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究等许多领域。荧光原位杂交是一门新兴的分子细胞遗传学技术，在原有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术，具有快速、安全、杂交特异性高、可以多重染色等特点，因此在分子细胞遗传学领域受到普遍关注。
