鲲羽生物 鲲羽生物 2024年09月28日 15:25 广东
在探索生命奥秘的征途中，科学家们不断寻求更加精准、高效的方法来揭示生物体内的复杂机制。免疫荧光技术，凭借其能够在微观尺度下直接观测生物分子间相互作用的能力，成为了生命科学研究中不可或缺的一部分。然而，正如任何精密仪器在测量时都可能受到干扰一样，免疫荧光实验中的背景问题也成为了研究者们必须面对和克服的一大障碍。
在荧光检测领域，自发荧光（Autofluorescence, AF）是一种常见的背景荧光现象，可能对实验结果造成干扰。今天，我们将深入探讨自发荧光的来源以及应对策略。
小鼠肝脏自发荧光（图源：鲲羽生物）
自发荧光是样本在荧光检测过程中产生的非特异性背景荧光信号，这些信号与研究的目标信号无关，可能对实验数据产生干扰。
自发荧光作为一个重要的干扰因素，其复杂性和多样性不容忽视。为了更深入地理解并有效应对这一问题，可以将自发荧光细分为两个主要类别：内源性物质自发荧光与样品处理引入的外源自发荧光。
1）内源性物质自发荧光：
细胞自发荧光，在细胞内存在着许多发光的生物分子，如荧光蛋白和发光酶等。当这些生物分子在合适的条件下受到激发时，会释放能量并发出光。荧光蛋白是一类广泛存在于自然界中的蛋白质,它们能够吸收外界的光能并发出某种特定波长的荧光。荧光蛋白的自发荧光可以用于细胞标记和研究细胞内的生物过程。除了荧光蛋白，一些细胞中的化学物质也可以自发发出荧光。例如，细胞内的某些代谢产物或代谢物的荧光，如NADPH、ATP等，可以在一定条件下发出荧光。
一些研究表明，红细胞的自发荧光可能与其内部的某些化学物质有关。除了红细胞中的血红素基团，由于其卟啉环结构而呈现红色自发荧光。此外，红细胞中的NADH在特定激发条件下，可能会发出荧光。还有一些研究显示，红细胞内的其他成分，如叶酸等，也可能导致一定的自发荧光。
小鼠脾脏中的红细胞自发荧光 （图源：鲲羽生物）
组织中存在许多会发生自发荧光的天然化合物，脂褐素是一种颗粒状的亲脂性色素，随着年龄增长会在骨骼肌，神经元和心脏等许多组织细胞中聚集，在500-695nm处发光最强烈。除此之外还有核黄素、弹性蛋白等也会产生自发荧光。
在植物细胞中，叶绿素的自发荧光是最为常见的，叶绿体自发荧光是由于叶绿素分子在光合作用中被激发所产生的。当太阳光线进入植物细胞时，它们会被吸收并转化为能量，这些能量被传递到叶绿素分子中，当能量达到一定水平时，叶绿素分子就会发出荧光。另外，木质素、阿魏酸、角质素、木栓质、孢粉质及黄酮类化合物等，均可能导致植物样本的自发荧光[1]。
水稻花药自发荧光 （图源：鲲羽生物）
2）交联固定诱导自发荧光：
戊二醛、多聚甲醛以及甲醛固定会造成不同程度的自发荧光背景。例如，戊二醛固定会导致显著的自发荧光增强，这是由于戊二醛与蛋白质及肽反应生成的近红外荧光物质，分子中的乙二胺和仲胺是形成 Cy3 类似物的关键成分[2]。
在某些情况下，自发荧光不仅会增加背景噪音，还可能掩盖或干扰目标信号的检测，对实验造成一定干扰。了解到不同来源自发荧光的产生机制和特点，研究者们便能根据其特性灵活选择精准有效的策略来去除或削弱这些背景信号，从而提高免疫荧光实验的准确性和可靠性。为应对自发荧光的挑战，研究者们采用：物理、化学及生信算法等多种方法来减小其干扰。
小鼠肺组织自发荧光淬灭剂前后处理（图源：鲲羽生物）
1）物理方法
光漂白：紫外线照射可有效降低自发荧光，例如照射肾脏、肝脏和胰腺切片降低自发荧光，但需注意高强度光照可能会导致组织成分的光氧化。
2）化学方法
组织透明化：通过化学处理，使组织变得透明，降低背景荧光。
暗淬灭：使用如苏丹黑B等化学试剂在荧光染色前后处理样本，减少自发荧光。
还原剂处理：使用氨乙醇、硼氢化钠等还原剂，可有效减少自发荧光的产生。
专用试剂盒：针对不同荧光类型，市面上有多种试剂盒（如：TrueBlack®、TrueView®和MaxBlockTM等）可用于处理自发荧光。
使用 TrueBlack® 处理淬灭脂褐质自发荧光（图源：Cell Signaling Technology）
使用 TrueView® 处理淬灭自发荧光（图源：Vector）
3）算法扣除
数字图像处理：应用特定算法从图像中去除自发荧光信号，可以兼容多种荧光基团，提升实验数据的准确性[3]。
自发荧光是荧光检测中的一个重要挑战，但通过合理选择和应用上述减弱方法，我们可以有效减少其干扰，从而获得更准确的实验数据，帮助我们更好地减少自发荧光带来的困扰。
希望这篇文章对你了解自发荧光的来源及处理方法有所帮助。如果你有任何问题或需要进一步的信息，欢迎留言讨论！
参考文献
