实验常用的巨噬细胞原代/细胞系-以及其注意事项

   吞噬作用是一种重要的细胞机制，在从原生动物到哺乳动物（包括人类）的所有多细胞生物中都得到了保留。巨噬细胞吞噬内源性物质，如凋亡细胞和细胞碎片、 2020 年）、细胞碎片或异物，如病原体和有毒物质，如石棉或二氧化硅颗粒。

   巨噬细胞在通过吞噬作用吞噬和消化微粒方面发挥着至关重要的作用，这一功能有助于根据巨噬细胞执行这一过程的效率和广泛程度来确定其分类中的不同亚型。

   为了扫描细胞外环境，巨噬细胞表达了许多表面和细胞质受体，这些受体能检测到生物体生理环境中通常找不到的不规则信号。这些受体包括结合凋亡和坏死细胞、疏松病原体和细胞碎片的清道夫受体； 模式识别受体（PRRs），用于检测 “非自身 ”或 “受损 ”信号，如 Toll 样受体（TLRs）、C 型凝集素受体（CLRs）、视黄酸诱导基因 1（RIG1）样螺旋酶受体（RLRs）、Fc 受体和 NOD 样受体（NLRs）。

   这些受体与配体的相互作用会吸引肌动蛋白丝使颗粒内化，然后将其包裹在吞噬体中。吞噬体与溶酶体融合形成吞噬溶酶体，导致货物降解。

   巨噬细胞可以通过清除受感染和死亡的宿主细胞来遏制感染的扩散。这种行为被称为胞葬，是一种保护机制，可在生长和重塑过程中清除组织中的垂死或死亡细胞 这一过程主要由组织巨噬细胞执行，在炎症开始时，由单核细胞衍生的巨噬细胞执行。

   在感染情况下，大量参与宿主防御的细胞会发生细胞死亡。当务之急是清除这些细胞，以尽量减少组织损伤和炎症。此外，由于这些细胞中往往藏有细胞内病原体，而这些病原体会因细胞死亡而失去栖息地，因此控制感染变得至关重要，这使得胞葬成为宿主应对细胞内细菌时不可或缺的过程。此外，胞葬促进巨噬细胞向抗炎表型转变，导致促炎细胞因子减少，抗炎介质释放增加，如白细胞介素（IL）-10 和转化生长因子-β（TGF-β）以及促溶解分子（溶解素和保护素），它们有助于减少感染期间的炎症。

   此外，胞葬在生长发育过程中的组织重组以及伤口愈合过程中也发挥着至关重要的作用。在复杂生物体的整个发育过程中，细胞死亡是一种自然现象，有助于生长和组织重组。因此，消除衰老和死亡的细胞对于保持组织平衡和结构至关重要，同时还能促进愈合过程。

   确保巨噬细胞有一个良好的环境对其发挥最佳吞噬细胞功能非常重要。细胞外基质（ECM）是一个复杂的系统，为免疫细胞提供结构支架。特别是，主要由成纤维细胞合成的胶原蛋白在促进各种细胞功能方面发挥着关键作用，包括髓系细胞的分化和粘附。此外，巨噬细胞和成纤维细胞的相互作用对于生长因子交换和减少异常增殖也很重要。最后，ECM 的改变可引发巨噬细胞的机械敏感反应，这对组织再生和纤维化至关重要。

   无论是从动物或人体样本中分离出的巨噬细胞，还是用生长因子从前驱细胞中分化出的巨噬细胞，无论是作为癌细胞系分离出的巨噬细胞，还是作为体外细胞系生成的巨噬细胞，其来源不同，仅根据其来源来了解巨噬细胞行为的改变是徒劳的。此外，巨噬细胞在机体发育、稳态、修复和对病原体入侵的免疫反应等过程中的功能至关重要，因此通过巨噬细胞的吞噬活性来描述巨噬细胞的特征还需要进一步扩展。

由于巨噬细胞是先天性免疫系统的关键组成部分，其发育在造血系统的一系列阶段中受到严格调控。多年来，人们普遍认为巨噬细胞是源自骨髓中造血干细胞（HSCs）的一个大体一致的群体，并经历了一个被称为单造血的明确发育过程。然而，最近的研究结果表明，成年小鼠组织中的大量巨噬细胞并不依赖造血干细胞，相反，它们起源于胚胎早期的卵黄囊前体。

这些前体细胞被称为前巨噬细胞（pMacs），它们通过血液循环进入各个器官。一旦离开血液并经历分化，它们就会形成其所栖息组织特有的遗传特征。这一成熟过程使巨噬细胞具备了适应特定组织环境的能力。由此产生的巨噬细胞可以扮演多种角色，既可以是维持组织平衡的常驻巨噬细胞，也可以是对感染或炎症刺激做出动态反应的活化巨噬细胞。组织常驻巨噬细胞具有自我更新能力，通常不依赖造血干细胞的输入。

此外，每个器官都含有不同寿命的单核细胞衍生巨噬细胞（MDMs），其中一些长期存在，而另一些寿命较短，并不断被来自骨髓的造血干细胞取代。这就导致了一种复杂的情况，即源自胎儿和造血干细胞的巨噬细胞在某些组织中共存。

在炎症部位，单核细胞被吸引到组织中并分化成巨噬细胞，巨噬细胞与常住细胞合作或取代常住细胞，以维持免疫力或促进炎症消退和组织再生。

   组织巨噬细胞显示出显著的功能多样性和可塑性，并受到周围组织的影响。利用条件报告基因的命运图谱技术进行的研究表明，大多数常驻组织巨噬细胞群在胚胎发育过程中建立，并通过自我更新维持到成年，骨髓祖细胞或血液单核细胞的贡献有限。组织巨噬细胞祖细胞（皮肤、脾脏、胰腺、肝脏、大脑）来源于卵黄囊和胎儿肝脏，或混合来源于卵黄囊和骨髓（肺脏、肾脏）。

   某些巨噬细胞群的特点是F4/80受体表达量较低，在某些情况下，如组织感染，它们可以从骨髓来源的祖细胞中得到补充。在基础状态下，常驻组织巨噬细胞在功能上表现出相当大的差异，需要不同的形态、转录反应和位置。这种功能异质性可能来自于常驻组织巨噬细胞与其支持的客户细胞之间的动态串扰。

   关于组织常驻巨噬细胞的作用已有综述。巨噬细胞根据其解剖位置和功能表型分为不同的亚群（图 1）。肠道中蕴藏着大量的组织常驻巨噬细胞。

  有趣的是，据信小鼠肠道组织驻留巨噬细胞会通过一种被称为 “单核细胞瀑布 ”的现象定期得到循环单核细胞的补充（A two-step human culture system replicates intestinal monocyte maturation cascade: Conversion of tissue-like inflammatory monocytes into macrophages). 胚胎前体定植于肠粘膜，并在原位显著增殖 在原位 在新生儿期进行大量原位增殖。然而，它们在断奶前后会被 Ly6C 高的 单核细胞所取代。这些单核细胞随后在局部成熟为抗炎巨噬细胞。这一过程主要受微生物群的影响，需要在整个成年期持续进行，以维持健康的肠道巨噬细胞群。

   组织巨噬细胞通过清除死亡和濒死细胞以及有毒物质来维持组织的健康。组织巨噬细胞还能抑制炎性单核细胞介导的炎症，从而确保组织在感染或损伤后恢复平衡。事实上，人体几乎所有组织中的单核吞噬细胞都被赋予了重要的平衡功能。

巨噬细胞具有惊人的可塑性，细胞因子信号可显著、特异性地改变其功能。由于巨噬细胞能够改变和适应各种外源性和内源性因子，因此它们可以通过一种被称为极化的过程迅速改变其功能特征。巨噬细胞极化是巨噬细胞对来自局部微环境的刺激做出反应的过程。在识别吞噬的物质和/或其他因素（如其他细胞分泌的促炎或抗炎细胞因子）后，几种信号通路被激活。这些途径最终导致特定巨噬细胞表型的形成，以满足功能要求。

目前，巨噬细胞领域的研究人员对各种巨噬细胞活化表型的分类达成了部分共识。最初，巨噬细胞活化依赖于一种简单的二元模型，如经典活化和替代活化概念，也称为 M1 和 M2。现在人们普遍认为，这种模式过于宽泛并被曲解，妨碍了对发病机制的理解。

经典的活化巨噬细胞（或 M1 样巨噬细胞）会释放大量促炎细胞因子，并产生抗微生物因子，如活性氧（ROS）。另一种活化的巨噬细胞（或 M2 样巨噬细胞）具有抗炎功能，并能调节伤口愈合和组织修复。此外，根据抗炎刺激的不同，M2 样巨噬细胞还有许多亚型：M2a、M2b、M2c、M2d。

目前关于巨噬细胞活化的主流观点是采用多维模型，将巨噬细胞在其独特的微环境中遇到的各种信号（即：M(IL-4)、M(IL-13)、M(IFN-γ)、M(LPS)）纳入其中。这一系统避免了分类的复杂性，因为不同的实验室可能会对活化做出不同的定义，从而能将新的活化条件与这些基本范例进行比较和对比。

巨噬细胞可根据感染或损伤等外源因素迅速调节其功能能力，从而表现出显著的表型可塑性。这些免疫效应器极具活力，最初参与促炎活动，随后过渡到促进消炎阶段。这种灵活性使巨噬细胞能够调节从炎症到恢复组织平衡的免疫反应。

总而言之，并不存在 “巨噬细胞 ”本身，而是存在一系列不同类型的巨噬细胞，它们不断检测和响应环境刺激以及组织生理，并相应改变其功能和代谢状态。由此可见，研究巨噬细胞生物学不可能有一个万能的模型，而是需要预先进行仔细的考虑。

巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）是一种生长因子，在人类和小鼠体内负责髓系祖细胞向巨噬细胞的增殖和分化。

在小鼠的血浆中，约有 10 毫微克/毫升的 M-CSF 通过体内各种细胞的分泌而持续存在，从而确保循环血液中单核细胞的招募和分化。在生理条件下，M-CSF 水平受集落刺激因子 1 受体（CSF-1R）介导的内吞调节，提供反馈控制，根据成熟巨噬细胞的数量调节巨噬细胞的生成。体内巨噬细胞的一个主要特征是其分化和存活依赖于 M-CSF 受体信号。

M-CSF 常用于体外从小鼠骨髓中的髓系祖细胞生成骨髓源性巨噬细胞（BMDM），并从外周血单核细胞（PBMC）分化出巨噬细胞，用于人类相关研究。这些细胞在体外分化和存活都需要 M-CSF。相比之下，腹腔巨噬细胞等体外巨噬细胞是作为成熟巨噬细胞分离出来的，因此不需要 M-CSF 进行进一步分化。然而，在体外培养过程中，如果不补充 M-CSF，它们只能存活 2-3 天（Characterization of murine macrophages from bone marrow, spleen and peritoneum.）。

与体外分化或体内外培养的巨噬细胞形成鲜明对比的是，巨噬细胞样细胞系 RAW264.7 和 J774 在体外培养或存活时不需要 M-CSF 或任何其他持续应用的生长因子。

Islam 等人报告说，RAW264.7 细胞产生的 M-CSF 极少，但在核因子卡巴 B（NF-κB）配体受体激活剂（RANKL）处理后，M-CSF 的产生量显著增加。另一项关于巨噬细胞样细胞系 RAW264.7 破骨细胞形成的研究表明，这种永生化细胞系会产生 M-CSF。此外，另一项研究通过酶联免疫吸附法检测了 RAW264.7 细胞上清液中的 M-CSF 水平（M-CSF cooperating with NFkappaB induces macrophage transformation from M1 to M2 by upregulating c-Jun.）。

查阅现有的高通量 RNA 序列数据，有两篇论文显示 RAW264.7 细胞中存在 M-CSF 的表达（Distinct persistence fate of mycobacterium tuberculosis in various types of cells.）。在脂多糖（LPS）的刺激下，M-CSF 的水平明显升高，而在感染结核分枝杆菌（Mtb）后，M-CSF 的水平下降。Andreu 等人发表的一篇文章显示，与 BMDM 相比，J774 细胞表达更高水平的 M-CSF 基因。随着时间的推移以及对J774细胞感染Mtb的反应，M-CSF的水平也在增加。表 1 汇总了已发表的 RNA 测序数据结果。

表 1 显示了每个生物重复的 M-CSF 基因的比对读数总数（原始计数；未显示），该数据取自已发表的数据，并通过平均值（Avg.counts）用于估计 M-CSF 的表达。M-CSF 的相对表达量是通过将 J774 和 BMDM、RAW264.7 未处理和 LPS 刺激或有Mtb感染的样本之间的比率。DESeq2 R软件包的独立过滤证实，所有值都通过了低表达基因的过滤阈值。

然而，目前只公布了 RNA 数据，还没有研究报告巨噬细胞系 J774 中的 M-CSF 分泌情况。因此，目前仍不清楚 J774 细胞是否自身分泌 M-CSF，因此不需要补充，或者该细胞系是否因其作为肿瘤衍生细胞固有的增殖能力而不需要 M-CSF。

一般来说，永生化巨噬细胞来源于肿瘤细胞，这些细胞表现出持续分裂，或者细胞经过刻意改造，可以无限增殖，因此可以培养无数代。然而，原代巨噬细胞是研究体外巨噬细胞功能的主要方法（Obstacles and opportunities for understanding macrophage polarization）。

每种体外巨噬细胞模型都有积极和消极的方面，在选择模型之前需要仔细考虑。

   几十年来，组织培养技术的发展和巨噬细胞系的建立一直是生物学研究中不可或缺的。类巨噬细胞系是揭示巨噬细胞功能的重要工具，RAW264.7 和 J774 细胞是细胞库中最常用的两种永生化巨噬细胞系。永生化巨噬细胞系有几个优点：（I）易于处理和自我复制，因此是具有各种遗传条件的无限细胞来源。(II)细胞几乎可以无限量培养，(III)可以长期冷冻保存，(IV)如果因污染等原因丢失，也很容易更换。

   不过，使用永生化巨噬细胞系也有一些局限性。它们要么来自癌变的单个细胞/肿瘤，要么由病毒感染产生。这就是为什么它们在培养和传代过程中容易发生基因型和表型漂移。因此，巨噬细胞系会丧失巨噬细胞特异性功能，并获得与体内细胞或原代分离细胞截然不同的分子表型。

   例如，RAW264.7 巨噬细胞缺乏含有 Caspase 激活和招募结构域（ASC）的凋亡相关斑点样蛋白，而 ASC 是各种炎症小体受体的适配分子（Pelegrin 等人，2008 年）。这就阻碍了 RAW264.7 细胞在受到 NLR family pyrin domain containing 3（NLRP3）的 nigericin、double-stranded DNA for absent in myeloma 2（AIM）和 Clostridioides difficile toxin b（TcdB）刺激后产生和分泌成熟的 IL-1β（而原 IL-1β 的产生不受影响）。用 ASC 亚基转染 RAW264.7 巨噬细胞可恢复原 Caspase 1 的裂解能力，随后产生和分泌成熟的 IL-β（Differential splicing of the apoptosis-associated speck like protein containing a caspase recruitment domain (ASC) regulates inflammasomes）。此外，随着传代次数的增加，RAW264.7 巨噬细胞中一些基因和蛋白质的表达也会波动。超过 50 次传代后，RAW264.7 巨噬细胞中缺氧诱导因子 1-α（Hif1a）、整合素亚基α L（Itgal）、分化簇 86（Cd86）等基因的表达量增加，而精氨酸酶 1（Arg1）、转铁蛋白受体 2（Trf2）和干扰素调节因子 8（Irf8）的表达量在 15 次传代后已经发生了变化。

   此外，RAW264.7细胞可以转染DNA，但原代巨噬细胞却会诱导细胞死亡，这表明该细胞系与原代巨噬细胞不可比。值得注意的是，J774 细胞与原代巨噬细胞相似，但与 RAW264.7 细胞不同，转染质粒 DNA 后会出现细胞死亡，而转染 mRNA 则不会出现细胞死亡。

   用对原代巨噬细胞的研究来验证巨噬细胞样细胞系的结果，对于确定巨噬细胞功能的特征非常重要。此外，与单一细胞类型的体外实验结果相比，进行动物实验可以进一步阐明体内的相关性。

   巨噬细胞样系 RAW264.7是从注射了阿贝尔森鼠白血病病毒（A-MuLV）的 BALB/c 小鼠体内分离出来的，阿贝尔森鼠白血病病毒是一种复制受损的病毒，携带 v-abl 酪氨酸激酶癌基因。当与合适的 C 型辅助病毒结合时，A-MuLV 可在体外转化胚胎成纤维细胞，并在体内引发迅速的 B 细胞淋巴白血病。因此，RAW264.7 细胞是一种具有巨噬细胞样能力的永生化癌细胞系。

   A-MuLV 是生物安全二级（BSL-2）制剂，对实验室人员和公众构成 “中度危害”，需要特定的安全规程。虽然巨噬细胞系源于A-MuLV诱导的肿瘤，但目前还不清楚A-MuLV基因组是否促成了细胞转化。A-MuLV 制剂通常包括辅助病毒，但在最初描述时，对复制能力强的病毒的检测结果为阴性。美国模式培养物保藏中心（ATCC）目前提供的 RAW264.7 细胞既能表达生态型 MuLV（表现出莫洛尼分离株的生物学特征），也能表达多向性 MuLV。多向性病毒的宿主范围很广，可感染多个物种或各种细胞培养系。另一方面，生态型病毒的特点是整合到细胞 DNA 中，并在细胞表面表达 A-MuLV 抗原。生态型病毒指的是宿主范围有限的病毒，只能感染一种或少数物种或细胞培养系。这些发现表明，在使用 RAW264.7 细胞进行实验设计和数据解读时必须谨慎。

   RAW264.7 细胞系被广泛用于描述巨噬细胞的吞噬功能。RAW264.7 细胞的最大优点是可以用各种方法（电穿孔、脂质感染）进行转染，而且相对容易用于 CRISPR-Cas9 慢病毒筛选。这有利于机理遗传无偏筛选研究。然而，持续传代甚至可能增加突变的积累，使细胞系与原代巨噬细胞的定义进一步分离。因此，尽管该细胞系可作为初步筛选巨噬细胞潜在重要因子和功能的实用工具，但与原代巨噬细胞和体内研究相比，必须考虑继续传代该细胞系可能导致基因耗竭，损害巨噬细胞的免疫功能。

小鼠原代巨噬细胞

与长期培养的永生化细胞系相比，培养和利用原代巨噬细胞具有若干优势。与永生化细胞系相比，原代巨噬细胞的寿命较短，长期培养可减少基因突变的积累。此外，原代巨噬细胞的来源也会影响研究结果。最重要的是要了解体外研究中使用的是哪种原代巨噬细胞，因为它们因培养方案和培养条件的不同而存在差异。

   腹腔巨噬细胞（PMs）是一种常用的体外模型，用于研究组织驻留巨噬细胞的反应。对腹腔巨噬细胞的分析有助于深入了解巨噬细胞的一般生物学特性以及对各种刺激和疾病模型的体内外行为。

   在处理巨噬细胞时，应考虑分离方案。PM可作为未刺激的常驻细胞获得。这种细胞通过腹腔灌洗分离出来，是对照、常驻组织巨噬细胞的最大来源之一。不过，建议使用巨噬细胞特异性标记物（如 CD11b 或 F4/80）进行分选，因为腹腔灌洗液中含有腹腔中存在的所有细胞，主要是 B 细胞，还有极少量的单核细胞和中性粒细胞。仅仅依靠培养井附着作为巨噬细胞纯化的 “分选 ”步骤，可能不足以实现完全纯净的腹腔巨噬细胞培养，这就是为什么作者建议使用腹腔渗出液细胞一词来表示未经进一步纯化的细胞。

   不过，在这种情况下，还必须提到的是，进一步的流式细胞分析会影响巨噬细胞的生物学特性。虽然通过纯化可以获得更高的纯度，但这反过来又以影响细胞的生物学特性为代价。此外，从小鼠体内提取对照腹腔巨噬细胞也有很大的缺点，因为只能获得有限数量的细胞（每只小鼠1x10 6个细胞），而且只有约 40% - 50% 是巨噬细胞。因此，必须牺牲更多的小鼠才能获得足够数量的细胞用于实验过程。

   因此，为了增强巨噬细胞的生成，可以在收集细胞之前向腹腔内注射无菌诱导剂（如硫代甘油酸盐）。硫代甘氨水由牛肉输液、蛋白胨、氯化钠、葡萄糖、硫代甘酸钠、琼脂、亚甲基蓝组成。研究表明，与对照原生质相比，硫代乙醇酸钠的成分可决定细胞内病原体的杀灭能力。诱导剂中琼脂和亚甲基蓝的减少可提高杀灭能力。

   施用巯基乙酸后，每只小鼠的巨噬细胞产量增加了 10 倍。研究表明，与对照组 PMs 相比，布鲁尔硫代甘油酸能引起巨噬细胞的显著招募，并导致活化水平的提高。尽管巨噬细胞数量增加，但布鲁尔硫代甘氨酸培养基作为一种刺激物，会引发炎症反应，导致常驻单核细胞/巨噬细胞总数迅速减少。随后，外周炎性单核细胞/巨噬细胞增加，同时常驻巨噬细胞逐渐恢复。这种招募可能会也可能不会影响基因表达。此外，它们还表现出溶酶体酶活性的增加和吞噬吸收的增加。

   有两项研究确定了存在于对照组和巯基乙酸诱导的腹腔中的多种白细胞群。然而，保持巨噬细胞培养的高纯度对于体外实验至关重要。据报道，新鲜分离的巯基乙酸诱导的腹膜细胞含有很高比例的巨噬细胞（86-95%），通过粘附，其纯度提高到近 99%。值得注意的是，仅根据 CD11b 或 F4/80 等以前被认为是 “巨噬细胞特异性 ”的抗原来评估巨噬细胞的百分比可能会产生误导。这是因为中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和树突状细胞等其他髓系细胞也表达这些抗原。将树突状细胞（CD11c）、嗜酸性粒细胞（Siglec-F）和中性粒细胞（Ly6G）的标记物包括在内可能是有用的，因为即使是微量的污染细胞也会影响体外检测的结果，导致数据误读。

   另一项研究显示，腹腔巨噬细胞的比例低于之前的报告，其中存在大量嗜酸性粒细胞。此外，有报告称腹腔巨噬细胞的粘附培养物中存在嗜酸性粒细胞污染（Isolation of functional mature peritoneal macrophages from healthy humans.）。污染细胞会影响对巨噬细胞进行的标准检测的功能读数。因此，嗜酸性粒细胞会妨碍对使用巯基胶囊诱导的腹腔巨噬细胞进行的体外研究结果的准确解释。嗜酸性粒细胞表现出几种细胞表面标记，如 CD45 和 CD11b，这些标记通常出现在炎症部位的其他造血细胞上，如肺泡巨噬细胞和中性粒细胞。在小鼠嗜酸性粒细胞表面发现了 Siglec-F，它是硅铝酸结合免疫球蛋白样凝集素（Siglec）家族的成员。Siglec-F 主要只在小鼠血液中的嗜酸性粒细胞及其骨髓中的前体上表达。除嗜酸性粒细胞外，腹腔渗出液细胞中的自然杀伤细胞也会明显影响有关巨噬细胞调节回路的结论。为了在分析中排除 NK 细胞可能造成的影响，可以在重组活化基因 2（RAG2）-γ 链敲除小鼠体内诱导腹腔巨噬细胞。为了尽量减少嗜酸性粒细胞的影响，可以使用双 GATA 位点（ΔdblGATA）基因敲除小鼠，例如，在这种小鼠中，嗜酸性粒细胞的发育受到严重影响。

   另一个需要考虑的要点是，由于分离方案的不同，巨噬细胞的代谢活性也会发生变化。对照状态下的常驻腹腔巨噬细胞表现出的代谢活性低于激发的巨噬细胞。诱导巨噬细胞的糖酵解和氧化磷酸化水平升高，这可能与其吞噬能力增强、成熟和活化水平提高有关。深入了解代谢途径与细胞功能之间的分子联系，对于制定通过代谢重编程调节巨噬细胞功能的策略至关重要。

   与PM相比，BMDM不是组织驻留巨噬细胞的模型，因为它们是在体外分化的。它们是通过冲洗小鼠后腿骨髓中的髓样祖细胞并用重组 M-CSF 或 L-929 细胞条件培养基（L929，M-CSF 的来源）刺激以获得分化的巨噬细胞而产生的。M-CSF 通过 M-CSF 受体介导的信号诱导祖细胞增殖和分化为 BMDM。

   使用 BMDM 作为巨噬细胞模型的主要优势在于分离和分化后产生的细胞量（每只小鼠 4-6 x10 6个细胞）。培养条件（培养基类型、M-CSF 的用量和 L929 的使用）的不同导致 BMDM 生成的差异很大。然而，为了保证结果的高度可重复性，必须对方法进行清晰的描述。在许多研究机构中，L929 上清液比使用重组 M-CSF 更受青睐，因为其成本效益高，能产生更多的分化巨噬细胞，需要安乐死的动物也更少。

   在重组 M-CSF 出现之前，许多实验室仍普遍采用传统方法，涉及使用 L929 永生化成纤维细胞系的上清液分化 BMDM，其中向发育中的 BMDM 前体提供 M-CSF 和各种其他因子。虽然某些品系的小鼠 L929 细胞有能力产生大量的 M-CSF，但不同批次的 L929 上清液成分可能存在差异，可能导致实验结果不一致。

   尽管暴露于 L929 上清液中的其他物质，L929 衍生的巨噬细胞仍表现出与 M-CSF 衍生的巨噬细胞相似的吞噬和病原体清除能力。然而，L929 衍生的巨噬细胞显示出不同的细胞因子分泌模式，炎性细胞因子水平较低，而 IL-10 分泌较高。与 M-CSF 衍生的巨噬细胞相比，它们还显示出更强的新陈代谢活性和更多功能失调线粒体的积累。虽然在新陈代谢和细胞因子分泌方面存在差异，但两种类型的巨噬细胞的杀微生物效果相当。

   通过质谱分析，对 L929 上清液的检测发现了 2,193 种蛋白质，其中包括大量的 M-CSF 和其他免疫调节蛋白质，如迁移抑制因子（MIF）、骨生成素和趋化因子，如 CC 趋化因子配体（CCL）2 和 CCL 7。与用 M-CSF 进行分化相比，用 L929 进行分化的巨噬细胞表现出更强的抗炎 M2 样表型。此外，在 L929 上清液中生长的巨噬细胞对氧化应激的反应减弱，细胞分裂和有丝分裂机制的活性降低（Proteomics characterisation of the L929 cell supernatant and its role in BMDM differentiation）。

   总之，这些研究结果表明，分化剂的选择会影响 BMDM 的表型和蛋白质组，从而导致生物功能的变化。因此，认识不同 BMDM 分化方法的生物学意义以及由此产生的体外结果至关重要。相反，采用规定浓度的 M-CSF 可减轻实验的可变性并提高实验室方法的标准化。

从小鼠骨髓衍生的巨噬细胞中生成细胞系

   已经介绍了几种使小鼠BMDM永生化以生成巨噬细胞系的方法；然而，在巨噬细胞中观察到的低转导和转染率给这些程序带来了挑战。本综述的下一部分将概述一些使原发性 BMDM 永生化的潜在方法。然而，我们必须仔细考虑这些方法的优缺点。

   与初始细胞群相比，对原代巨噬细胞进行基因修饰可导致其表型发生变化（Phenotypic comparison and the potential antitumor function of immortalized bone marrow-derived macrophages (iBMDMs)）。不过，永生化 BMDM 可减少动物用量。来自转基因小鼠的 BMDM 经常被用来分析免疫系统的机制，而这些永生化 BMDM 储备库可随时用于体外研究，减少对活体动物的依赖。

   一种利用Cre-J2逆转录病毒感染技术使特定小鼠品系的巨噬细胞群体永生的方法。这种永生化方法涉及用 J2 重组逆转录病毒感染细胞，该病毒来源于复制缺陷的 3611-Moloney 肉瘤病毒（MSV），含有 v-raf 和 v-myc 致癌基因。

   J2 病毒本身缺乏重要的病毒包装蛋白（gag-pol、env），使其复制缺陷。因此，一种名为 Psi-Cre-J2（来源于 NIH 3T3 成纤维细胞）的病毒包装辅助细胞系被用来生成重组 Cre-J2 逆转录病毒。用于永生化的 Cre-J2 逆转录病毒感染技术已被证明对多种小鼠巨噬细胞群有效，如那些来自骨髓、胎儿肝脏、脾脏和小胶质细胞的巨噬细胞群。

   市场上有一种永生化的小鼠巨噬细胞系，名为 BM A3.1A7，来源于从成年雌性 C57BL/6 小鼠骨髓中提取的粘附巨噬细胞。这些细胞通过引入高水平的 raf 和 myc 致癌基因而获得永生。

   目前只有一项研究分析了永生化的小鼠巨噬细胞系 BM A3.1A7 的巨噬能力。他们证实，BM A3.1A7 可极化为 M1 型巨噬细胞（通过分泌 IL-1β、IL-6、IL-12 和肿瘤坏死因子（TNF）等炎症细胞因子以及诱导型一氧化氮（NO）合酶（iNOS）的表达增加）或 M2 型巨噬细胞（以典型的 ARG1 活性升高为特征）。要更好地评估该模型的价值，还需要进一步研究并与其他原代巨噬细胞或其他相关模型进行比较。

   此外，造血前体可通过逆转录病毒转导雌激素诱导型转录因子同工酶 B8（Hoxb8）而永生。Hoxb8 可促进自我更新并阻止分化。当激素β-雌二醇水平升高超过生理范围时，Hoxb8转录活跃。去除β-雌二醇后，Hoxb8 失活，导致永生化祖细胞分化，具体分化情况取决于所需髓亚群的细胞因子鸡尾酒。因此，这些细胞可在细胞培养中生长数周，为它们提供足够的时间进行基因改造，同时仍能成熟为DC细胞、巨噬细胞或粒细胞。从 Hoxb8 系衍生出的巨噬细胞表现出相似的表型和功能属性，在受到 LPS 刺激时，与原代巨噬细胞一样，活化相关基因的表达量也会升高。

   这些细胞的优势在于它们可以很容易地从任何小鼠品系的骨髓或胎儿肝脏中产生。此外，Hoxb8 细胞可通过病毒转导和 CRISPR 介导的基因组编辑进行有效改造。它们是蛋白质过表达或敲除实验的便捷工具。这些细胞的一个缺点是异质性，因为最初的骨髓群体可能是多样化的，这可能会影响所产生细胞的一致性。

   对巨噬细胞进行遗传操作一般比较麻烦。例如，有将 RNAi 导入巨噬细胞或逆转录病毒转导骨髓祖细胞的方案。RNA引导的内切酶Cas9的发现及其作为基因剪刀（“基因组编辑”）的应用开辟了新的技术可能性，即利用CRISPR（簇状规则间隔短回文重复序列）-Cas9从表型出发，通过所谓的 “前向遗传筛选 ”在全基因组范围内寻找生物过程的调控因子。将 Cas9 蛋白导入细胞是 CRISPR-Cas9 过程中的一个难题。为了克服这一难题，Cas9基因敲入小鼠有助于在永生细胞中产生各种基因敲除，这已在Cas9表达小鼠的永生DCs中得到证实。

   如前所述，通过逆转录病毒转导 Hoxb8 实现永生化的造血前体可培养数周，允许基因修饰并成熟为 DC、巨噬细胞或粒细胞，因为 Hoxb8 的表达促进自我更新并阻止分化。为了通过去除β-雌二醇来克服Hoxb8过表达的诱导性，通过慢病毒转导对Cas9转基因小鼠的骨髓进行永生化，引入强力霉素调控版的转录因子Hoxb8。加入强力霉素和嘌呤霉素后，这些细胞可持续培养数周。此外，由于Cas9基因在细胞中表达，这些细胞有利于CRISPR/Cas9技术的应用。

   最近的一项研究通过使用 CRISP/Cas9 技术创建新的永生化巨噬细胞系，重点研究了在原代巨噬细胞和永生化细胞系之间观察到的显著差异和制约因素（Cas9(+) conditionally-immortalized macrophages as a tool for bacterial pathogenesis and beyond.）。Roberts及其同事通过逆转录病毒转导将ER-HoxB8导入Cas9表达小鼠的造血干细胞，并对Cas9+-永生化巨噬细胞（CIMs）和原代巨噬细胞类型BMDM进行了全面比较。通过一系列精心设计的实验，他们考察了巨噬细胞的各种功能，包括iNOS表达、NO生成、细菌吞噬和抗菌活性。CIMs与BMDM相似，唯一的显著区别是对李斯特菌的杀伤力增强了，他们推测这是由于通过吞噬-溶酶体途径提高了早期清除能力的结果。结核杆菌在 CIMs 中的生长速度与在 BMDM 中观察到的生长速度相似。在 LPS 和干扰素-γ 的联合刺激下，CIMs 和 BMMs 的 iNOS 表达增加，产生的 NO 水平相当。

如前所述，许多研究只关注巨噬细胞的主要作用，即吞噬作用。然而，巨噬细胞并不仅仅是清道夫；它们通过产生复杂的反应对各种环境线索做出反应，如产生活性氧和氮物种（ROS 和 RNS）以及促炎或抗炎细胞因子和趋化因子，这取决于它们的极化。

越来越明显的是，巨噬细胞样细胞系不同于原代巨噬细胞，而原代巨噬细胞则因分离和培养方法的不同而不同。本综述的后续部分将说明这些区别。

对照 PM 和 BMDM 之间的差异

   小鼠原代巨噬细胞（包括 BMDM 和 PM）通常被用于体外研究各种机制，如感染控制、吞噬作用和细胞因子产生。有趣的是，这两种巨噬细胞类型表现出明显的功能差异。

   不同解剖位置的巨噬细胞可能表现出不同程度的异质性。采用流式细胞术观察发现，BMDM 在正向散射和侧向散射数据中都形成了紧密的集群，这与对照组 PMs 形成了鲜明对比，后者至少分散在两个不同的群体中（Bone marrow-derived and elicited peritoneal macrophages are not created equal: the questions asked dictate the cell type used.）。这些发现表明，原生动物表现出明显的异质性。相反，BMDM 表现出更高程度的一致性，这可能归因于 M-CSF 的诱导。此外，由于含有更多的细胞质和溶酶体含量增加，与 BMDM 相比，PM 的细胞体积更大。此外，BMDM 的增殖也得到了增强，细胞数量从第 4 天开始增加，并持续到第 14 天，与 PM 相比，BMDM 的细胞数量比基线增加了 60 倍，而 PM 在 14 天的培养期内没有增殖。

   BMDM与PM不同，不能激活一种称为LC3相关吞噬（LAP）的抗微生物吞噬变体。在细菌感染期间，BMDM 不仅不能诱导 LAP，而且在吞噬体 ROS 生成和细胞内细菌杀灭方面也表现出明显的能力下降。通过 NADPH 氧化酶（Nox）2 产生的 ROS 对 LAP 诱导至关重要。我们的研究发现，与 PM 相比，BMDM 中几个 Nox2 亚基的蛋白水平明显较低，这阐明了 BMDM 中 ROS 生成的明显减少。此外，与 PM 相比，Nox2 衍生的 ROS 生成所必需的上游成分，即整合素 Mac-1 和鞘磷脂酶 ASMase，在 BMDM 蛋白水平上也显著减少。

   此外，与 PM（感染后 5 小时）相比，BMDM（感染后 24 小时）的细胞因子分泌时间更慢。Bisgaard等人对体外动脉粥样硬化模型中PM和BMDM的行为进行了比较研究，发现胆固醇处理后趋化因子和细胞因子的表达存在巨大差异，PM表现出M1样表型倾向，而BMDM则表现出M2样表型倾向。Wang 等人的研究表明，与 PMs 相比，BMDM 表现出最高的吞噬能力）。有趣的是，与年轻小鼠相比，年老小鼠的 PMs 的吞噬效率会降低。另一方面，在 BMDM 中没有观察到与年龄相关的吞噬功能障碍，这表明这些细胞群没有内在缺陷。

   有几项研究调查了巯基乙酸诱导的原生质（TG-PM）与原生质质粒（BMDM）之间的差异。Weber 和 Schilling 证实，与来自 BMDM 的溶酶体相比，从 TG-PM 分离出来的溶酶体表现出更强的溶酶体数量、更活跃的凝血酶 B 以及更高水平的原凝血酶 D和溶酶体相关膜蛋白 1（LAMP1）。与 Bisgaard 等人的研究相比，Zajd 及其同事最近的一项研究发现，TG-PM 显示出 M2 表面标记，而 BMDM 显示出 M1 表面标记。此外，TG-PM 的反应能力下降，包括吞噬能力下降、对额外极化刺激的反应减弱以及细胞因子和趋化因子分泌减少。然而，这两项研究都忽略了 TG-PM 和 BMDM 与非诱导型天真 PM 的对照。这种对照至关重要，因为注射巯基乙酸盐会诱发无菌炎症，在分离和实验开始前显著改变Naive腹腔巨噬细胞。

   Zajd 等人的研究表明，在流式细胞术中，两种类型的巨噬细胞形态相似。然而，BMDM 表现出更高的吞噬活性，并在极化反应中更强地上调趋化因子和细胞因子的表达。BMDM 反应性的增强反映了其内在的差异，而 TG-PM 的反应则受其在整个动物体内分化的影响。与 TG-PM 相比，BMDM 表达更高水平的炎症标志物（如 Ly6C 和 CD64），并显示出更多的模式识别受体（如 TLR2 和 TLR4）表达。不过，它们的 MHCII 表达量不高，这表明它们是类似 M1 的偏斜，而不是完全激活。

   尽管观察到了这些差异，但这些研究表明，对照腹腔巨噬细胞因其更自然的状态而成为首选的组织驻留模型。然而，与腹腔巨噬细胞相比，用 M-CSF 分化的 BMDM 对极化细胞因子的敏感性更高，吞噬能力更强。因此，它们是研究巨噬细胞可塑性和对感染的免疫反应的有利模型。

   它们代表了一种有价值的替代方法，尤其是在获得大量用于分离目的的动物受到限制的情况下。然而，尽管为实验程序获得更高的细胞数量非常诱人，但使用表型高度改变且反应性降低的 TG-PM 仍需谨慎。

   对 J774 和 PM 进行比较后发现，与 J774 细胞相比，PM 从未修改的低密度脂蛋白（LDL）中储存了大量的胆固醇酯。基于这些发现，与原代 PM 相比，J774 巨噬细胞在低密度脂蛋白存在的情况下表现出更为活跃的酰基辅酶 A（CoA）：胆固醇酰基转移酶（ACAT）胆固醇酯化途径。此外，在小鼠 PM 中，乙酰-低密度脂蛋白和低密度脂蛋白对 ACAT 的刺激有明显区别，即使脂蛋白匹配降解时也是如此。

   与原发性 PM 相比，J774 对新型隐球菌变种grubii株 H99（血清型 A）的感染控制不同。J774 巨噬细胞样细胞系在整个感染过程中表现出激活 Caspase-1 和 Caspase-3 的倾向。随后，对原生 PM 进行了检查，发现 Caspase-3 被激活。尽管 ROS 生成增加，但与 J774 细胞相比，真菌在 PM 中的控制能力减弱。

   此外，与 RAW264.7 细胞相比，PM 的基础 NF-κB 水平更高，并且在低剂量 LPS 激活时 NF-κB 核转位动力学更快。值得注意的是，与永生化细胞系相比，原代小鼠 PM 的 NF-κB 转位动力学尤其迅速。

BMDM 与永生化巨噬细胞系之间的差异

原代巨噬细胞类型之间的差异主要源于分离和培养方案的不同。然而，与原代巨噬细胞相比，类巨噬细胞系因其癌症来源而表现出显著差异。

虽然有些报告发现 RAW264.7 细胞和 BMDM 在抗菌和抗寄生虫活性等基本参数上没有差异，但其他研究则强调了显著的区别。例如，一项调查FAS相关因子1（FAF1）对ROS产生的调控作用的研究显示，在感染李斯特菌（L.m）后，RAW细胞产生的IL-6和IL-12明显少于BMDM，但NO却多于BMDM。两种细胞类型的细胞 ROS 生成总量相同。

Huang 等人检测到，与 RAW 细胞相比，BMDM 中的 septin 水平更高，这表明它们在吞噬体形成过程中的重要性。此外，另一项研究对 RAW264.7 和 BMDM 的吞噬体进行了全面的蛋白质组学分析。对超过 2,500 种吞噬体蛋白质进行了量化，并分析了甘露糖受体 1 和 Siglec-1 等重要受体的显著差异。此外，Guo 等人还观察到，与永生化巨噬细胞系相比，BMDM 中的吞噬体通过与内膜和溶酶体的融合经历了更快的成熟，这一现象通过荧光吞噬试验得到了证实。对这两种细胞类型的吞噬体蛋白质组的分析表明，58种蛋白质为BMDM所特有，17种蛋白质为RAW吞噬体所特有，其中免疫相关蛋白质（TLR3、TLR9、补体受体、甘露糖受体1以及几种整合素和galectins）在BMDM吞噬体中更为丰富。考虑到与腹腔巨噬细胞相比，BMDM 中的整合素蛋白水平降低，RAW 细胞与组织巨噬细胞之间的这种差异变得更加明显。

有趣的是，BMDM 和 RAW 细胞表现出相似的表型，其特点是 CD11b 和 F4/80 表达水平升高。然而，尽管这两种细胞群有相似之处，但它们的表型并不完全相同；RAW 细胞的 CD14 表达明显更高，这突出了它们的不同特点。此外，BMDM 和 RAW 细胞对poly I:C 的 TLR3 刺激表现出相似的反应，表明它们在单核-巨噬细胞分化过程中有共同的激活途径。对各种刺激的相似反应表明它们的分化过程中有一个共同的功能点。

此外，与 BMDM 相比，J774 细胞不表现出抗纤溶活性。Andreu 等人观察到，与 J774 细胞相比，BMDM 对结核分枝杆菌的感染控制能力更强。此外，BMDM 的感染控制更快、更强。在C. neoformans感染过程中，J774巨噬细胞样细胞系倾向于激活caspase-1和caspase-3，而BMDM则激活caspase-1、-3和-8。 蛋白质表达分析表明，在感染早期，J774细胞中的受体相互作用蛋白（RIP）和凋亡诱导因子（AIF）上调，而BMDM则激活AIF并释放细胞色素c。此外，J774 细胞的 LDH 水平升高，表明细胞坏死，而 BMDM 则不同，它表现出典型的细胞凋亡特征。

巨噬细胞的来源、培养时间、生物材料表面的特征、培养基以及在培养条件中添加补充剂共同影响着培养中巨噬细胞的表型。

胎牛血清和细胞培养基对巨噬细胞培养的影响

   在细胞培养基中添加胎牛血清（FBS）或胎牛犊血清（FCS）是促进细胞生长和增殖的重要补充。自 1950 年以来，在细胞培养基中添加 FBS/FCS 已成为一种标准程序。FBS 由细胞生长和维持所需的关键元素组成，如激素、维生素、转运蛋白、微量元素和生长因子。无血清培养基是养牛业的副产品，是从怀孕母牛屠宰过程中牛胎儿的血液中获取的。虽然哺乳动物和昆虫细胞系以及原代培养存在各种无血清培养基配方，但过渡到无血清培养基需要大量的文献查阅和制造商搜索合适的配方。

   FBS 是一种复杂多变的混合物，可能含有污染物，并因地理、季节和环境因素而存在显著差异，从而导致批次与批次之间的差异。

   一项研究分析了各种市售 FBS 对上皮细胞的影响。研究结果表明，各种 FBS 样品能明显刺激细胞分泌 IL-8，而不会引起 TNF 和 IL-1β 的分泌。相反，一些 FBS 样品对 IL-8、TNF 和 IL-1β 的分泌没有影响。

   此外，用 LPS 培养 Fisher 344 大鼠时，FBS 中的外泌体也会影响其原代巨噬细胞。与在补充了去除了外泌体的 FBS 的培养基中培养的巨噬细胞相比，巨噬细胞中的 IL-1 呈剂量依赖性下降。此外，加入胎牛外泌体还能降低巨噬细胞的 TNF-α 和 IL-6 水平。

   由于外泌体在体液中稳定，能反映母细胞的生理状态，并能通过生物分子的转移促进细胞间的交流，因此有可能成为一种可靠的生物标志物。高水平的血清蛋白，包括从牛细胞中提取的外泌体，可能会污染外泌体样本，导致产量中出现大量杂质和伪影。因此，有必要采用不含血清的方法。Abramowicz 等人的研究表明，外泌体中存在高水平的血清蛋白污染会给外泌体的收获、分离和处理带来重大问题。

   另一个值得考虑的问题是溶血。溶血会将游离血红蛋白和其他细胞内内容物释放到血清中，从而极大地影响 FBS 的生产，这会改变血清的成分，影响其在细胞培养应用中的性能和一致性。

   此外，微量的内毒素（脂多糖：LPS）被认为会污染市售的 FBS。Beninson 等人指出，内毒素污染通过诱导产生各种活性介质（如 TNF）来影响培养细胞，从而导致多种细胞反应。有趣的是，对内毒素的耐受性是巨噬细胞的一个众所周知的特征，从而导致巨噬细胞反应的改变。对感染或损伤的先天免疫反应从促炎转变为抗炎。单核细胞/巨噬细胞初次接触 LPS 后，会出现暂时的 “内毒素耐受 ”状态，其特征是对 LPS 的反应性降低。

   在动物模型中，内毒素耐受分为两个阶段：一个是细胞活化改变的早期阶段，另一个是针对革兰氏阴性菌多糖侧链产生特异性抗体的晚期阶段。耐受的生理作用是保护宿主组织免受因长时间产生促炎细胞因子而造成的损害。虽然 LPS 耐受大多是可逆的，但它会产生一种混合的巨噬细胞活化状态，这种状态主要是促炎性的，但也包括明显的抗炎调节特征。

   不仅 FBS 可能受到内毒素污染，培养基也是一个潜在来源。目前，大多数商业制备的培养基都经过了内毒素检测，并认证其含量低于 0.1 ng/mL。然而，添加到培养基中的试剂也会引入内毒素。Dumoulin 等人测试了五种不同批次的商业制备的牛血清白蛋白，发现内毒素含量从 0.1 到 12 纳克/毫升不等。此外，另一项研究发现，一些培养基添加剂（如促红细胞生成素）的内毒素含量高达 50 纳克/毫升。因此，内毒素检测对细胞培养实验至关重要，可确保实验结果的可靠性和有效性。

   此外，使用不同的细胞培养基会影响巨噬细胞的表型。Kawakami 等人提出了新的证据，证明在 Ham's F-12 培养基（F-12）或 Dulbecco's 改良鹰培养基（DMEM）中培养的 J774 在 LPS 和/或干扰素-γ（IFN-γ）刺激下表现出不同的活化巨噬细胞表型。具体而言，在巨噬细胞活化过程中，DMEM 与 F-12 相比，NO 和某些细胞因子的产生量明显更高。

   巨噬细胞能在玻璃和塑料表面有效粘附和增殖，因此，培养皿的表面是关键。正常组织细胞悬浮在液体中通常无法存活，因此它们被认为是依赖锚定的。这些细胞必须粘附在固体上，固体可以是坚硬的玻璃，也可以是比婴儿皮肤还要柔软的表面。一些细胞在软材料上的行为方式对于识别重要表型至关重要。

   据报道，上皮细胞和成纤维细胞最先检测到软基质与硬基质的不同并做出不同反应。尽管分子途径仍未完全清楚，但肌肉细胞、神经元和其他各种组织细胞已被证明能感知基质的硬度。细胞对传统材料刚性的感知和反应是否不同于更顺从的组织、凝胶或细胞子层，这一问题的答案越来越清晰和肯定，这不仅对标准细胞培养，而且对理解疾病过程、形态发生和组织修复策略都具有重要意义。

   巨噬细胞细胞因子的表达取决于细胞类型和培养表面。在 Chamberlain 等人对原代巨噬细胞或永生化巨噬细胞系的研究中，由于培养皿的三种不同固体表面，细胞表现出不同的反应。细胞系之间在粘附形态、增殖、细胞因子表达和细胞表面标志物表达方面表现出差异性。

   相反，另一项研究表明，这四种无细胞毒性生物材料的表面化学性质对细胞因子的产生影响不大。而在小鼠单核-巨噬细胞（RAW264.7 和 J774）、小鼠巨噬细胞（IC-21）和小鼠成纤维细胞（NIH 3T3）细胞系中，细胞粘附在聚合物表面并随后增殖的能力存在差异。

   材料表面化学成分会影响巨噬细胞的表型表达。一项研究发现，不同表面的巨噬细胞表现出不同的细胞因子/趋化因子特征，亲水性/中性表面的巨噬细胞数量较少，但活化程度较高。随着时间的推移，观察到细胞因子的产生从促炎转变为抗炎，这表明炎症反应得到了缓解。

   总之，巨噬细胞的信号改变和功能变化可能取决于培养皿表面、血清添加量和细胞培养基。

永生化人类巨噬细胞系

   THP-1 细胞是从患有急性单核细胞白血病的一岁儿童的外周血中分离出来的。与 RAW 细胞系类似，THP-1 单核细胞样细胞也在不断增殖，并可在传代过程中积累多种突变。尽管这些细胞最初主要用于白血病癌症研究，但它们很快就适应了人类单核细胞/巨噬细胞模型细胞系，这可以通过使用光甘油 12-肉豆蔻酸 13-乙酸酯（PMA）或人 rM-CSF 处理分化成巨噬细胞样细胞来实现。此外，与 BMDM 一样，THP-1 细胞也缺乏一致的分化方案。在一项比较条件的研究中，研究人员发现，最佳的 PMA 浓度能使 THP-1 细胞对抗细胞内的细菌，而高浓度则会导致细胞更快死亡。较低浓度可支持细胞存活并有效防御细胞内细菌，如原代人类巨噬细胞。

   与人类原代单核细胞或巨噬细胞相比，THP-1 细胞具有多项技术优势。其中一个关键优势是它们具有统一的遗传背景，从而降低了细胞表型的变异性。与 RAW 细胞系一样，THP-1 衍生的巨噬细胞可以很容易地用质粒 DNA 进行转染。此外，使用小干扰 RNAs（siRNAs）对 THP-1 细胞进行基因修饰以下调特定蛋白质表达也相对简单（THP-1 cell line: an in vitro cell model for immune modulation approach.）。

   有几篇文章比较了 THP-1 单核细胞与人类 PBMC-单核细胞的反应。Chanput 等人对结果进行了很好的总结。在基因表达和细胞因子分泌水平以及基线基因表达方面都观察到了差异。

   因此，使用 THP-1 细胞的一个局限性是，与 PBMCs 和人类单核细胞衍生巨噬细胞相比，其恶性背景和受控条件下的培养可能会导致不同的敏感性和反应。例如，与 THP-1 细胞相比，单核细胞对 LPS 的反应明显更强。人类外周血单核细胞对 LPS 的显著反应性主要是由于 CD14 的高表达水平。THP-1 细胞表达的 CD14 水平较低，因此与原代单核细胞相比，它们是研究 LPS 反应的不良模型。在体内系统中可引发严重、危及生命反应的 LPS 浓度对 THP-1 细胞无毒。

   人B细胞前体白血病细胞系BLaER1是通过转染伯基特淋巴瘤细胞系Seraphina（一种急性淋巴细胞白血病细胞系，CCAAT/增强子结合蛋白（C/EBPα）、雌激素受体（ER）耦合绿色荧光蛋白（GFP）而得到的。转染后，根据 GFP 表达对细胞进行分选，从而产生了一个子克隆。祖细胞系来源于一名染色体易位 t（1；19）、8 三体综合征和 ALL 女性患者的骨髓。通过他莫昔芬或β-雌二醇，转录因子C/EBPα被激活，导致未成熟/成熟B细胞转化为巨噬细胞样细胞。BLaER1细胞的转录组在C/EBPα诱导前与外周血B细胞的转录组接近，而在C/EBPα激活3-4天后与正常巨噬细胞的转录组接近。有趣的是，诱导淋巴细胞转化为巨噬细胞的频率明显高于体细胞通过与胚胎干细胞相关的转录因子重编程为诱导多能干细胞时观察到的频率。大肠杆菌和白色念珠菌感染实验表明，重编程巨噬细胞具有吞噬细胞的功能。BLaER1 单核细胞支持利什曼寄生虫感染和随后活化的能力与原代人类巨噬细胞相当。此外，感染引起的细胞因子反应与 M-CSF 衍生的巨噬细胞和 GM-CSF 衍生的巨噬细胞相当。

   BlaER1 细胞的一个优点是，通过利用基于 CRISPR-Cas9 的成熟方法，可以在未分化的 B 细胞形态中实现基因修饰，这与在其他单核细胞中观察到的有限的基因操作能力相比，具有明显的优势。

   人类细胞模型的选择是一个需要慎重考虑的关键决定。例如，仅在 BlaER1 细胞中记录了替代性 NLRP3 激活，这凸显了选择适当模型的重要性。这种物种特异性的 NLRP3 炎症小体通路在人和猪外周血单核细胞中被发现，然而在鼠源细胞和 THP-1 细胞系中却不存在。

   来自人类外周血单核细胞（PBMC）的分化巨噬细胞是另一种常用的人类巨噬细胞。除了常规的血液采集外，还可采用一种称为 “白细胞分离”（apheresis）的技术来自动分离特定的血液成分。在分离 PBMC 时，这种自动化过程被称为白细胞分离。

   使用人类 rM-CSF 或 GM-CSF 将 PBMC 分化为巨噬细胞的方案已被描述，但研究结果表明，这种方法并不能将 PBMC 分化为巨噬细胞，但迄今为止的研究在技术方法上存在很大差异。不同的分离方法可能会对巨噬细胞的结果产生重大影响，导致产量、纯度、存活率和细胞表型的变化。例如，白细胞分离产生的细胞量高于常规采血。

   采血前或采血过程中出现的因素会影响白细胞介素，进而影响检测结果。例如，压力诱导与抑制细胞因子合成和释放免疫抑制细胞因子有关。

   影响 PBMC 功能的另一个因素是营养状况。无论是由于长期整体营养不良造成的急性饥饿，还是由于特定营养素缺乏造成的急性饥饿，这种影响都会削弱机体对抗病原体或对疫苗接种做出反应的免疫反应能力

   采血时间是另一个因素。人类和小鼠的免疫系统，包括淋巴细胞在血液和组织间的移动，都遵循昼夜节律，导致免疫细胞数量在一天中的变化（Circadian control of the immune system.）。此外，在分离之前，血液运输和储存的时间和温度也会影响分离过程和后续检测。除了降低细胞活力，粒细胞污染也是样本质量随时间下降的主要原因。

   在设计涉及 PBMCs 的体外实验时，对单核细胞分离技术进行深思熟虑的评估至关重要。

   诱导多能干细胞（iPSCs）通过细胞重编程和定向分化过程，提供了从任何遗传背景创建各种疾病相关细胞类型的机会。iPSCs 是未分化的多能细胞，具有无限期培养的潜力。

   Yanagimachi等人于2013年发表了五步单核细胞系分化方案。该方案通过单核细胞阶段从人类 iPSCs 分化出成熟的巨噬细胞。最后一步是用 M-CSF 培养 CD14+ 单核细胞系细胞一周，以进行巨噬细胞分化（Robust and highly-efficient differentiation of functional monocytic cells from human pluripotent stem cells under serum- and feeder cell-free conditions.）。

   iPSC 衍生的巨噬细胞显示出显著的吞噬细菌能力，尽管与血液单核细胞衍生的巨噬细胞相比，这种能力有所减弱。不过，据观察，促炎反应和转录组图谱与血液单核细胞衍生巨噬细胞相当。有人认为，iPSC 衍生巨噬细胞的吞噬活性较低的一个原因可能是偏向于更抗炎的表型，也许与组织常驻巨噬细胞更相似。

   iPSC 可以从具有特定遗传背景的患者身上产生，并通过慢病毒转导或 CRISPR-Cas9 基因编辑等多种机制进行修饰。此外，对原始 iPSC 培养系进行基因修饰以大量产生各种特定基因变体的可能性，可能是大规模研究（如与药物开发相关的研究）的一种有价值的方法。

人与小鼠巨噬细胞的比较

   巨噬细胞生物学的一个争论焦点是啮齿动物和人类巨噬细胞之间的差异。有人提出，人的巨噬细胞可能与啮齿类动物的巨噬细胞有本质区别。特别是关于 ARG1 和 iNOS 的表达，因为它们在免疫防御中发挥着重要作用，而诱导人类单核-巨噬细胞细胞系轻易产生 iNOS 是一项挑战。此外，与小鼠细胞相比，原代人类单核细胞中的抗菌产物衣康酸要低两百倍。

   此外，将人类单核细胞亚群与小鼠亚群进行比较的微阵列分析表明，不同物种的基因表达模式存在差异。最近的一项研究利用深入的 RNA 测序，从 24 种不同类型的人类和小鼠肺、淋巴结巨噬细胞、人类血液和小鼠脾脏巨噬细胞中收集了全面的基因表达谱数据集。在前 1,000 个标记基因中，只有 130-230 个基因在人和小鼠巨噬细胞群体中是共享的。了解小鼠和人类巨噬细胞之间的差异是不利的，因为不同的物种可能会产生不同的结果。

   图 2总结了最常用的小鼠和人类巨噬细胞类型的优缺点。

其他物种的巨噬细胞

   能产生各种巨噬细胞系的物种之一是鸡。与巯基乙酸诱发小鼠的巨噬细胞相似，鸡腹膜中的炎性巨噬细胞也是以 Sephadex 作为刺激物招募的。这些巨噬细胞能通过溶酶体酸水解作用有效地吞噬和分解细菌。永生化的鸡巨噬细胞系为巨噬细胞研究提供了额外的资源。

   鸡巨噬细胞系，如 MQ-NCSU 和 HD11，在研究中被广泛使用。HD11 源自鸡骨髓，由禽骨髓细胞瘤病病毒 MC29 型转化而成，具有巨噬细胞的特征，包括形态和 ROS 生成增强。来自马立克氏病病毒感染肉鸡脾脏的 JM/102W 株的 MQ-NCSU 显示出恶性和单核吞噬细胞系的特征。甚至可以从从鸡翼静脉获得的肝素化血液中分离出原始单核细胞。

   此外，源自牛组织的巨噬细胞也常用于体外模型。来自牛外周血的单核巨噬细胞可用于体外感染实验、巨噬细胞极化研究和细胞因子产生。此外，通过肺灌洗获得的肺泡巨噬细胞也被用于分析对病原体的免疫反应。此外，用牛分枝杆菌和副结核分枝杆菌感染从牛髂嵴产生的 BMDM，通过分析细胞因子的产生和基因表达水平来确定潜在的诊断生物标志物。

巨噬细胞是多细胞生物体中最具可塑性和多功能性的细胞类型之一，其特点是具有多种信号识别能力、在新陈代谢方面的细胞适应能力、其受体库、产生和分泌的一系列物质，以及各种形式的吞噬和内吞作用。由于巨噬细胞存在于几乎所有人体组织或体液中，因此它们会不断检测环境变化和组织生理变化并做出反应，相应地调整自身的功能和新陈代谢状态。细胞类型的选择取决于提出的具体问题。因此，在研究巨噬细胞的功能和行为时，选择与体内环境非常相似的巨噬细胞类型至关重要，这样才能准确地代表所研究的组织巨噬细胞类型。

然而，这种方法在原代巨噬细胞类型的分离和培养方面往往极具挑战性。细胞培养基、血清和细胞培养皿等变量都会影响巨噬细胞的功能，因此需要对它们的潜在影响有必要的了解。

这些观察结果表明，在解释体外研究时需要谨慎，因为它们不一定能准确反映体内表型。因此，必须用涉及原代巨噬细胞的研究来验证巨噬细胞样细胞系的研究结果，以准确描述巨噬细胞功能的特征。这一点与对人类有重要意义的结果尤其相关，因为人类巨噬细胞表现出的特殊反应和相互作用可能不同于小鼠巨噬细胞系。