原创 发酵菌人 微生物知识库 2024-05-18 22:55 北京
为了保证实验能够在无菌环境下顺利进行，仅仅依靠培养液、器械和试验环境等彻底消杀是远远不够的，这些都是前提条件。操作人员身上或多或少都会携带各种微生物，有可能再次污染环境，再加上空气的流通性，也增加了再次污染实验室的可能性。
因此，为了试验的顺利开展，最大限度地避免杂菌污染，需要我们熟练并规范地进行无菌操作，无菌操作是试验成功的关键，必须严格遵守操作规程，以确保实验的顺利进行。
在微生物学实验操作过程中，在微生物实验工作中，控制或防止各类微生物的污染及其干扰的一系列操作方法和有关措施。
无菌操作技术主要包括两个方面：创造无菌操作环境和在操作和培养过程中防止一切其他微生物的侵入的措施，也就是无菌操作技术。
二、无菌操作原则
1. 区分无菌区和非无菌区，操作前戴好口罩、手套和工作服；
2. 放入超净工作台里的物品，必须经过灭菌，不能摆放太挤；
3. 使用完，一定要将无关物品全部取出来，紫外照射后关闭；
4. 操作要在酒精灯旁边操作；
5. 保证接种针冷却后再转移目标菌；
6. 灼烧接种针上多余的菌种，以免污染环境。
三、无菌操作环境
一般情况，在使用前，打扫卫生，用84消毒液或新洁尔灭擦拭台面和地面，打开紫外灯照射30min以上，使用时，关闭紫外灯，通风10min再进入操作。对于不需要洁净间，或没有洁净间的实验室，也要定期进行消杀。
对于大肠杆菌发酵培养，经常污染噬菌体，需要经常用臭氧消杀实验室。
（1）使用前，用75%酒精擦拭操作台面和四周，放入待使用物品（已经全部灭菌），打开紫外灯照射30min。（2）使用时，打开风机5min后，进入超净工作台操作。
（3）使用后，将无关物品全部取出，擦拭台面，打开紫外灯照射5min，关机。
进入超净工作台前，用75%酒精擦拭双手，进入超净工作台内，待酒精挥发完全，点燃酒精灯，将接种环及金属棒在火焰上灼烧，将接种环烧至发红，来回灼烧金属棒，尤其是接口处。
2. 接种针冷却
配制好固体或液体培养基后，利用高压蒸汽灭菌锅进行灭菌，经过灭菌后培养基里无任何微生物，在超过经工作台内，用接种针等将目标菌种接种到培养基中的过程叫无菌操作。
简单来说，在无菌条件下，将目标菌种转接到无菌培养基上的过程叫无菌操作。
利用接种环将目标菌种在固体培养基表面划线，菌种逐步稀释，培养后能够长出许多单一菌落，从而达到菌种分离纯化的目的。
①取菌种：取出目标菌种，融化后，备用；
②接种针灭菌：灼烧接种针进行灭菌；
③接种针冷却：将接种针移至酒精灯旁边冷却；
④蘸取菌种： 甘油管用75%酒精消毒，待酒精挥发完全，在酒精灯火焰略微灭菌（防止烤糊），然后用接种环蘸取一环菌种；
⑤划线：取已经备好的固体平板，边转动平板边用酒精灯火焰灭菌，打开平板（靠口朝酒精灯），用上述接种环在平板上划线，先在一侧连续划线3-4次，边转动平板边用酒精灯灼烧接种环，冷却后，用接种环穿过第一次划线部分继续划线3-4次，同样方法进行第三次划线，或第四次划线（根据菌液浓度和菌种类型确定划线次数），灼烧接种环；
⑥标记：在平板底部边缘处标记菌种名称，日期和其他信息；
①取菌种：取出目标菌种平板；
②接种针灭菌：灼烧接种针进行灭菌；
③接种针冷却：将接种针移至酒精灯旁边冷却；
④挑取菌种：在火焰旁打开平板塞子，边转动平板边用酒精灯火焰灭菌，打开平板（靠口朝酒精灯），立即将接种环伸入平板上，挑取单菌落后盖上平板盖子，然后左手迅速取出新鲜试管，在火焰旁右手小指取下塞子，并灼烧试管管口，将黏有单菌落的接种环迅速放进新鲜斜面的底部，从下至上Z字划线，盖上试管塞，灼烧接种环；⑤标记：在平板底部边缘处标记菌种名称，日期和其他信息；
（3）液体接种
五、注意事项
1.所有试验都必须在无菌条件下进行，在打扫卫生、实验室消毒过程中，一定要做好个人防护。
2.试验过程中，一定要正确使用酒精灯，避免着火。
3.区分灭菌物品和未灭菌物品，以免混乱，影响试验结果。
4.试验结束一定要将无关物品从超净工作台中取出，该灭菌的物品一定要灭菌后再处理，避免交叉污染。
5.采用菌落沉降法定期检查实验室情况。
6.试验过程中，尽量减少人员流动。
7.试验过程中，避免手部接触试管口、三角瓶等，以免造成污染。
8.试验过程中，如果出现意外，比如说着火，别着急，拿上湿抹布覆盖即可。
