发酵菌人 微生物知识库 2024-04-22 21:32 北京
微生物种类繁多，数量庞大，但它们既微小又透明，我们根本没法看清楚，更别说研究它们。要想观察细菌，必须采用特殊的染色方法将微生物着色，这样既方便观察也便于鉴别菌种。
细菌染色法是为了便于观察和研究而利用有关染料使细菌细胞着色的方法。细菌染色方法很多，根据不同的目的采用不同染色方法。细菌染色法作为微生物学实验中最为基础的技术，在实验室过程中广泛使用，所以学会细菌染色是进入微生物实验室的第一步。
正染色是强化标本的结构，即染色剂与样品结合，增强其散射电子的能力，最终在荧光屏上形成正象。
负染色是将标本包埋在染色物质里，借助染色剂增强背景对电子散射的作用，而标本在荧光屏上形成暗背景下的亮，故又称“衬托染色法”、“间接染色法”。
在负染色法中，标本不需要热固定，细胞不会因为化学药物的影响而变形，对于不易染色的细菌或病毒也能观察。接下来，按照实验原理、实验步骤、注意事项以及疑难解答等几个方面向各位小伙伴们一一进行详细阐述。
一、简单染色法
简单染色法，又叫单染色法，就是使用一种染料对细菌染色的方法，是实验室常用的一种染色技术，主要用于观察细菌的形态和大小，但不能用于鉴别细菌。
1、实验原理
主要基于细菌细胞在特定条件下的表面电荷性质和染料的化学性质。
（1）在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而常用的碱性染料（如美蓝、结晶紫、碱性复红、沙黄、孔雀绿等）在电离时，其染色部分带正电荷。因此，这些碱性染料的染色部分很容易与带负电荷的细菌结合，使细菌着色。
（2）利用单一染料对细菌进行染色，染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，从而更清楚地观察到细菌的形态和结构。
（1）结晶紫液：结晶紫乙醇饱和液(结晶紫2g溶于20mL95%乙醇中)20mL，1%草酸铵水溶液80mL，将两液混匀置24h后过滤即成。 （2）番红溶液：番红O2.5g，95%乙醇100mL，溶解后可贮存于密闭的棕色瓶中，用时取20mL与80mL蒸馏水混匀即可。
3、应用
简单染色法操作简便，适用于菌体的一般形态和排列的观察。
4、实验步骤
（1）准备。一般载玻片浸泡在酒精中清洗油渍，在实验之前，用镊子取出，在酒精灯火焰上方灼烧一下，去除酒精。
（2）涂片。在洁净的载玻片上滴加一滴无菌水，然后用无菌接种环挑取适量细菌悬浮液并涂成薄膜。
（3）固定。在酒精灯上方加热，但要注意温度不要过高，以免破坏细菌的形态，手指轻叩微烫即可。也可以使用化学固定剂（如甲醛）来固定细菌，以确保细菌的形态不受损失。
（4）染色。滴加染液覆盖涂片，让细菌与染液充分接触，通常染色时间为1-3min。
（5）冲洗。用洗瓶冲洗涂片，直到流出的水中无染液颜色为止。
（6）干燥。将涂片自然晾干或用吸水纸轻轻吸干。
（7）镜检。使用显微镜观察细菌的形态和结构。
5、影响因素及注意事项
（1）涂片：厚度不合适，过厚或过薄都会影响观察。涂片不均匀，染色不均匀，深浅不一，影响观察效果。
（2）固定：微热即可，不需要太热，菌体形态容易改变。
（3）染色：染色时间的长短要灵活掌握，不能死记时间，要根据染液浓度和涂片的厚度适当调整。到处需要积累经验没办法。
（4）染色过程中勿使染色液干涸。
（5）涂片须完全干燥后才能用油浸物镜观察。
二、革兰氏染色法
革兰氏染色法（Gram Staining）是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，1884年由丹麦医师汉斯·克里斯蒂安·革兰(Hans Christian Gram，1853年-1938年)创立。未经染色的细菌，由于其与周围环境折光率差别甚小，故在显微镜下极难观察。染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，而用以分类鉴定，革兰氏染色属于复染法。这种染色法利用细菌细胞壁上的生物化学性质不同，将细菌分成两类，即革兰氏阳性（Gram Positive，G+）与革兰氏阴性（Gram Negative，G-）。通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇或丙酮脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经沙黄等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。（2）卢戈氏碘液：碘0.33g，碘化钾0.66g，蒸馏水100mL。先将碘化钾溶于少量蒸馏水中，然后加入碘使之完全溶解，再加蒸馏水至100mL即成。配成后贮于棕色瓶内备用，如变为黄色即不能使用。
3、应用
应用于细菌检测，细菌的鉴别和分类，病毒的检测以及生物样品的特性分析。
4、实验步骤
革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法如下：
（1） 制片：固定，操作同上；
（2）初染：滴加草酸铵结晶紫染色1min，水洗；
（3）媒染：滴加革兰氏碘液（碘-碘化钾溶液）染色1min，水洗；
（4）脱色：滴加体积分数为95%的乙醇，约45s后水洗；
（5）复染：滴加番红染液染色3min，水洗并使之干燥；
（6）镜检：革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。
5、影响因素及注意事项
（1）选用活跃生长期菌种染色，老龄的革兰氏阳性细菌会被染成红色而造成假阴性。
（2）涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性。
（3）脱色是革兰氏染色是否成功的关键，脱色不够造成假阳性，脱色过度造成假阴性。
（4）如用火焰固定涂片时，将涂面向上，通过火焰数次，以手接触玻片，稍感烫手时即可。要防过热，否则使细菌变形或影响染色反应。
三、抗酸性染色法
抗酸性染色法（acid-fast staining method）是一种鉴别染色法，在普通微生物实验室不太常用。该染色法1882年由埃利希（F．Ehrlich）首创并经F．齐尔（Ziehl）改进而创造出的细菌染色法。
1、实验原理
结核分枝杆菌对苯胺染料一般不易着色，若加温或延长染色时间使其着色后，再用3%盐酸酒精处理也不易脱色，经此染色后，结核分枝杆菌及其他分枝杆菌呈红色，而非抗酸菌和细胞杂质等呈蓝色。
2、染液的配制
（1）石炭酸复红液：碱性复红4g，溶于95%酒精100mL作成饱和溶液，再取该饱和液10mL与5%石炭酸溶液90ml混匀即成。
（2）3%盐酸酒精液：浓盐酸3mL加入95%酒精97mL中即成。
（3）吕(Loeffer)氏美蓝染色液：美蓝2g，溶于95%酒精100mL中，作成饱和液。再取该饱和液30mL与0.01%氢氧化钾水溶液100mL混合均匀即可
3、应用
主要用于结核分枝杆菌和奴卡菌的染色鉴定。
4、实验步骤
（1）涂片：取菌悬液，在清洁无油脂载玻片上涂开，涂抹区约拇指盖大。
（2）固定：涂片自然干燥后，用片夹挟住玻片一端，通过火焰固定。
（3）染色：涂抹面用滤纸片盖上，然后往滤纸片上滴加石炭酸复红染液，使滤纸片完全被染液浸湿，持载玻片在小火上加温片刻然后离开火焰，此时可见到玻片上冒出蒸气。待蒸气消失后再加温，如此反复3~4次，约5min，加温时随时添加染液勿使纸片干涸。
（4）冲洗：玻片冷却后，用接种环挑去滤纸扔到污物盆内，流水冲洗玻片。
（5）脱色：滴加3%盐酸酒精脱色，至涂抹均匀部位基本没有红色再脱下为止，水洗。
（6）染色：滴加吕氏美蓝染液30s，水洗，干燥。
（7）镜检。
5、注意事项
（1）生物样品在使用时禁止直接接触，避免感染。
（2）使用完需要灭菌处理并且放置到指定位置统一处理。
四、芽孢染色法
1、实验原理
芽孢染色法是利用细菌的芽孢和菌体对染料的亲合力不同的原理，用不同染料进行着色，使芽孢和菌体呈不同的颜色而便于区别。
（1）芽孢壁厚、透性低，着色、脱色均较困难，因此，当先用一弱碱性染料，如孔雀绿或碱性品红在加热条件下进行染色时，此染料不仅可以进入菌体，而且也可以进入芽孢，进入菌体的染料可经水洗脱色，而进入芽孢的染料则难以透出，若再用复染液（如番红液）或衬托溶液（如黑色素溶液）处理，则菌体和芽孢易于区分。
（2）芽胞具有高度的折光性，外膜致密，渗透性低，故普通染色法不易使其着色，芽胞染色法是根据芽胞既难以着色，而一旦着色又难以脱色的特点设计的。所有芽胞染色法都基于同一个原则：采用着色力强的染料，并加热以促进标本着色，然后使菌体脱色，而芽胞上的染料仍保留，经复染后，菌体和芽胞呈现不同的颜色。
2、染液的配制
（1）5%孔雀绿水溶液：孔雀绿5.0g，蒸馏水100mL。
（2）0.5%番红溶液：番红O(safranine，又称沙黄O)2.5g, 95%乙醇100mL，溶解后可贮存于密闭的棕色瓶中，用时取20mL与80mL蒸馏水混匀即可。
3、应用
芽孢染色法是生物学和医学领域中常用的实验技术，用于观察和研究细胞的结构和功能。芽孢的大小、形状及其在菌体内的位置是鉴别细菌的重要依据。
4、实验步骤
（1）制片：常规方法涂片、干燥、固定。
（2）浸染：将固定好的涂片放入含5%孔雀绿水溶液的50℃水浴染色缸中，浸染15min。
（3）冲洗：取出载玻片，用水冲洗多余染液，直至出水无色为止。
（4）复染：0.5%碱性番红复染1min。
（5）冲洗：用水冲洗多余染液，直至出水无色为止，干燥。
（6）镜检。
5、注意事项
（1）选用适当菌龄的菌种，幼龄菌尚未形成芽孢，而老龄菌芽孢囊已经破裂。
（2）加热染色时必须维持在染液冒蒸汽的状态，加热沸腾会导致菌体或芽孢囊破裂，加热不够则芽孢难以着色。
五、荚膜染色法
荚膜染色法是一种典型的负染色法。
1、实验原理
（1）荚膜是由细胞壁分泌并聚积在细菌细胞壁表面的一层松散的黏液物质，没有明显的边缘，其成分因不同菌种而异，主要是葡萄糖与葡糖醛酸组成的聚合物，有的也含有多肽与脂质。
（2）荚膜作为细胞外碳源和能源性储藏物质，能保护细胞免受干燥的影响，同时能增加某些病原菌的致病能力，抵御宿主吞噬细胞的吞噬。由于荚膜的化学成分对染液结合力很弱，不易着色。但荚膜的渗透性比较好，通常可采用衬托法将染料透过菌膜，使菌体和背景着色，而荚膜不着色，这样荚膜从菌体周围衬托出来，呈现透明圈。
（3）荚膜含水量在90%以上，因此，制片时一般自然干燥或置于30-40度的培养箱烘干固定，以免荚膜皱缩变形。
2、染液的配制
齐氏苯酚复红染色液：
A液：称取0.3g碱性复红，95%乙醇，在研钵中研磨后，分批加入95%乙醇中，继续研磨使其溶解，配制成A液。
B液：称取5克苯酚，溶解在95mL蒸馏水中，配制成B液。
混合A液和B液即可。根据染色需要稀释5-10倍使用，但稀释液不易多配，以免变质失效。
3、应用
用于菌体荚膜的染色。
4、实验步骤
（1）涂片：取一干净载玻片，滴加一滴蒸馏水于载玻片中央，将接种环在酒精灯火焰上充分灼烧，冷却后挑取少量褐色区域湿润而黏稠的菌落于蒸馏水滴中，充分把菌分散开（一般2-3min才能分散均匀）。
（2）干燥：将涂片自然干燥或30-40度的培养箱烘干固定。
（3）染色：干燥后在涂面上滴加适量齐氏苯酚复红染液，染色3-5min。
（4）水洗：斜置载玻片，在自来水龙头（或洗瓶）下用小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。
（5）背景涂黑色素：从载玻片一端滴加1-2滴苯胺黑或碳素墨水，轻轻晃动载玻片，使苯胺黑均匀分布于载玻片上。将载玻片上的苯胺黑对准日光灯，用吸水纸把多余的锛胺黑吸掉，让光线能够透过即可。
（6）干燥：将载玻片自然干燥或30-40度的培养箱烘干。
（7）镜检：用高倍镜和油镜观察细菌荚膜形态。
5、注意事项
（1）固定和染色过程中不能加热，自然晾干或30-40度的干燥箱内烘干。
亚甲基蓝染色是一种常见的细胞和组织染色方法，通过染色剂亚甲基蓝将细胞核和细胞质染色，帮助研究人员观察细胞结构和功能。
1、实验原理
（1）利用染色剂亚甲基蓝与DNA或RNA结合后呈现不同的颜色，从而观察细胞核和细胞质的结构和形态。（2）亚甲基蓝是一种带正电荷的碱性染料，可以与DNA和RNA的负电荷结合形成亚甲蓝-DNA或亚甲基蓝-RNA复合物。当亚甲基蓝与DNA或RNA结合时，会吸收特定波长的光线并反射出不同的颜色。DNA和RNA与亚甲基蓝结合的程度不同，因此呈现出颜色的深浅也不同，这使得亚甲基蓝染色成为了观察细胞核结构及其他亲核物质定量分析的一种有效方法。54mL95%乙醇与40mL四氯乙烷混合摇匀后，于65摄氏度水浴3min，取出后加0.6g亚甲基蓝，混匀后冷却至4℃，加6mL冰乙酸，混匀后砂芯漏斗过滤，常温保存。（1）细胞染色：亚甲基蓝染色法可以用于观察细胞形态、细胞核的大小和形状等细
胞特征。
（2）染色体分析：通过亚甲基蓝染色法可以观察和分析染色体的数量、结构和缺陷
（3）核酸染色：亚甲基蓝染色法可以用于检测DNA和RNA的存在和定量。（4）细胞增殖分析：亚甲基蓝染色法可以用于观察细胞增殖和细胞周期。（5）细胞毒性分析：通过亚甲基蓝染色法可以评估药物或化合物对细胞的毒性。
（1）固定：将待染细胞或组织用4%的多聚甲醛或其他适当的固定液固定，一般固定
（2）染色：将固定的细胞或组织连续浸入亚甲基蓝染色液中，染色时间一般为2-3分钟。染色液的配制可以根据实验需要进行调整。
（3）冲洗：用去离子水或缓冲液轻轻洗涤染色的细胞或组织。洗涤时间根据需要可
（5）镜检：用高倍镜和油镜观察细菌形态。
（1）固定液的选择和浓度要适当，过浓或过稀都会影响染色效果。
（2）染色液的浓度和染色时间要控制好，过浓或过浅都会导致染色不均匀。
（3）洗涤过程要轻柔，避免造成细胞或组织的破坏。
（4）染色后要及时观察和记录结果，避免染色体颜色褪色或变化。
亚甲蓝染色法是一种常用的细菌染色方法，它可以使细菌的染色体染上蓝色，同时可以区分细菌活菌与死菌。
在染色结果中，活菌的染色体呈现出深蓝色，而死菌则呈现出浅蓝色或无色。这是因为亚甲蓝对细胞膜和染色体的亲和力较弱，只有在活菌中才能充分渗透并染色。而死菌细胞膜已经破裂，亚甲蓝无法渗透到细胞内部染色体上。
