病原微生物实验室生物安全操作规程

在学校病原微生物实验室实验过程中，由于实验工作人员生物安全意识不强或实验操作技术不规范、实验仪器使用不当等原因，常常容易发生微生物气溶胶吸入、刺伤、割伤、皮肤黏膜污染、食入以及被感染的实验动物咬伤等等生物危险。为了堵绝学校病原微生物实验室各类生物危险情况的发生，切实保障全校师生员工的身体健康和生命安全，根据国家《病原微生物实验室生物安全管理条例》和《海南医学院病原微生物实验室生物安全管理办法》，结合我校病原微生物实验室实际情况，特制定本操作规程。

一、病原微生物实验室实验工作人员必须牢固树立生物安全意识。

1．操作人员必须经过培训，通过考核。

2．掌握关键的危险步骤，设计出可行的防护措施并掌握其细节。

3．熟悉各级生物安全实验室运行的一般规则，掌握各种仪器设备的操作步骤和要点，对于各种可能的危害非常熟悉。

4．掌握各种感染性物质操作的一般准则和技术要点。

二、生物安全实验室操作规程

（一）标准微生物操作：

1.实验时，未经实验室主任同意，限制或禁止进入实验室。

2.进行活体处理后，实验人员要洗手；离开实验空前脱手套。

3.不许在工作区域饮食、吸烟、清洗隐型眼镜和化妆。食物应存放在工作区域以外专用橱柜或冰箱中。

4.不能用嘴移液，只能用机械装置移液。

5.制定锐器安全使用规范。

6.所有的操作过程应尽量细心，避免产生溅出和气溶胶。

7.实验完毕、下班前、活体溅出或溢出时，都应使用对病源有效的消毒剂进行台面消毒。

8.所有的培养物、储存物及其它规定的废物在释放前，均应使用可行的消毒方法进行消毒，如高压灭菌。转移到就近实验室消毒的物料应置于耐用、防漏容器内，密封运出实验室。

9.实施控制昆虫和龋齿动物的程序.

(二)特殊操作：

1.在开展有关传染病源工作时，实验室主任应禁止或限制人员进入实验室。一般情况下，易感人员或感染后会出现严重后果的人员，不允许进入实验室或动物房，例如，患有免疫缺陷或免疫抑制的人，其被感染的危险性增加。实验室主任对每种情况的估计和决定谁能进入实验室或动物房工作，负有最终责任。

2.实验室主任应制定规章和程序，只有告知潜在风险并符合进入实验室特殊要求(如，经过免疫接种)的人，才能进入实验室。

3.存在外源性病源时，实验室入口处应贴有生物危险标志，并显示以下信息：有关病源、生物安全级别、免疫接种要求、研究人员姓名、电话号码、在实验室中必须佩带的个人防护设施、出实验室所要求的程序。

4.实验室人员接受适当的、和实验室中处理或将要处理的病源有关的免疫接种或测试(如，乙肝免疫接种或TB皮试)。

5.根据所处理的病源，适当时，收集和储存适合于实验室人员和有风险人员使用的基本血清样品。根据所处理病源或设施的功能，应定期收集其他血清样品。

6.实验室主任为实验室人员特别制定的标准操作程序或生物安全手册中，应包括生物安全程序。对于有特殊风险的人员，要求阅读并在工作及程序上遵照执行。

7.实验室主任保证实验及其辅助人员接受适当的培训，包括和工作有关的可能存在的风险、防止暴露的必要措施和暴露评估程序。当程序必需改变时，有关人员必须每年更新知识，接受附加培训。

8.对于污染的锐器，必须时刻保持高度的警惕，包括针、注射器、玻片、加样器、毛细管、手术刀。

（1）针和注射器或其他锐器应限制在实验室内，类似灌肠、静脉切开放血、或实验动物液体吸出等，可以用其他器具的，就不要用锐器。可能时，用塑料器具代替玻璃器具。

（2）注射和吸取感染材料时，只能使用针头固定注射器或一次性注射器(即注射器和针头是一体的)。用过的一次性针头必须弯曲、切断、破碎、重新套上针头套、从一次性注射器上去掉，或在丢弃前进行人工处理，要不将之小心放入不会被刺穿的、用于收集废弃锐器的容器中。非一次性锐器必须放置在坚壁容器中，转移至处理区消毒，最好高压杀菌。

（3）适当时，使用带针头套的注射器、无针头的系统和其他安全设施。

（4）打碎的玻璃器皿不能直接用手处理，必须用其它工具处理，如刷子和簸箕、夹子或镊子。盛污染的针头、锐器、碎玻璃的容器在到掉前，应按照地方、州、联邦的规定进行消毒。

9．培养物、组织，体液标本，或具有潜在传染性的废物要放入带盖的容器中，以防在收集、处理、储存、运输或装卸过程中泄露。

(三)安全设备(第一道屏障)

l.进入实验室时，要穿上实验防护服。不得在实验室外穿防护服。重复使用的衣服在清洗前要消毒，衣服被明显污染后应更换。

2.在处理传染源、感染动物及被污染的仪器时，必须戴手套。

3.建议经常更换手套和洗手，一次性手套不能重复使用。

4.有关传染源的所有操作、感染动物的验尸、从感染动物或胚胎卵采集组织或液体等，都应在II级或III级生物安全柜中进行。

5.当操作不能在生物安全柜中进行时，应适当的综合使用个人防护设施(如，口罩，面罩等)和物理遏制设施(如：带安全罩或密封转头的离心机)。

6.当进入内有感染动物的房间时，应采取呼吸和面部保护措施。

(四)实验室设施(第二道屏障)

1.实验室要离开建筑物内的行走区，禁止随便进入实验室。进入走道后，至少需要经过两道自动门，才能进入实验室。所有的门都应有锁。过道里可以设计一个更衣室。

2.每个实验室有一个洗手池，洗手池的操作应该是免接触式或全自动的，洗手池应安装在门口附近。

3.实验台表面应能防水、耐热、耐有机溶剂、耐酸碱和用于工作台面及设施消毒的其他化学物质。

4.实验室的操作台应能承受预期的重量。实验台、安全柜以及设备间的空间便于打扫。

5.所有的窗门必须关闭和密封。

6.有实验垃圾处理设施及其使用方法，该设施最好设在实验室内(即，高压锅、化学消毒剂、焚烧炉、其他可行的消毒方法)。应有消毒设备使用方法。若垃圾运出实验室，应适当密封，并不应通过公共通道运送。

7.应配置生物安全柜，安全柜放置地点应远离门、房间通风百叶窗、实验室内行走区。

8.应有管道化的排气系统，该系统进入实验室的风向应从“洁净区”到“污染区”。

9.实验室内应有眼睛冲洗装置。

10.光线适宜于开展所有的工作，避免反光和闪光，以免妨碍视觉。

三、微生物学技术规范

（一）生物安全柜的使用规范

1．应参考国家标准制定操作手册。特别需要明确：当出现溢出﹑破损或不良操作时，安全柜就不再能保护操作者。

2．生物安全柜运行正常时才能使用。

3．生物安全柜在使用中不能打开玻璃观察挡板。

4．安全柜内应尽量少放置器材或标本，不能影响后部压力排风系统的气流循环。

5．安全柜内不能使用本生灯，否则燃烧产生的热量会干扰气流并可能损坏过滤器。允许使用微型电加热器，但最好使用一次性无菌接种环。

6．所有工作必须在工作台面的中后部进行，并能够通过玻璃观察挡板看到。

7．尽量减少操作者身后的人员活动。

8．操作者不应反复移出和伸进手臂以免干扰气流。

9．不要使实验记录本﹑移液管以及其他物品阻挡空气格栅，因为这将干扰气体流动，引起物品的潜在污染和操作者的暴露。

10．工作完成后以及每天下班前，应使用适当的消毒剂对生物安全柜的表面进行擦拭。

11．在安全柜内的工作开始前和结束后，安全柜的风机应至少运行5min 。

12．在生物安全柜内操作时，不能进行文字工作。

（二）实验仪器设备使用规范

1．移液管和移液辅助器的使用规范

（1） 应使用移液辅助器，严禁用口吸取。

（2） 所有移液管应带有棉塞以减少移液器具的污染。

（3） 不能向含有感染性物质的溶液中吹入气体。

（4） 感染性物质不能使用移液管反复吹吸混合。

（5） 不能将液体从移液管内用力吹出。

（6） 刻度对应（Mark-to-mark ）移液管不需要排出最后一滴液体，因此最好使用这种移液管。

（7） 污染的移液管应该完全浸泡在盛有适当消毒液的防碎容器中。移液管应当在消毒剂中浸泡适当时间后再进行处理。

（8）盛放废弃移液管的容器不能放在外面，应当放在生物安全柜内。

（9）有固定皮下注射针头的注射器不能够用于移液。

（10）在打开隔膜封口的瓶子时，应使用可以使用移液管的工具，而避免使用皮下注射针头和注射器。

（11）为了避免感染性物质从移液管中滴出而扩散，在工作台面应当放置一块浸有消毒液的布或吸有消毒液的纸，使用后将其按感染性废弃物处理。

2．离心机的使用规范

（1）在使用实验室离心机时，仪器良好的机械性能是保障微生物安全的前提条件。

（2）应按照操作手册来操作离心机。

（3）离心机放置的高度应当使小个子工作人员也能够看到离心机内部，以正确放置十字轴和离心桶。

（4）离心管和盛放离心标本的容器应当由厚壁玻璃制成，或最好为塑料制品，并且在使用前应检查是否破损。

（5）用于离心的试管和标本容器应当始终牢固盖紧（最好使用螺旋盖）。

（6）离心桶的装载、平衡、密封和打开必须在生物安全柜内进行。

（7）离心桶和十字轴应按重量配对，并在装载离心管后正确平衡。

（8）操作指南中应给出液面距离心管管口需要留出的空间大小。

（9）空离心桶应当用蒸馏水或乙醇（异丙醇，70％）来平衡。盐溶液或次氯酸盐溶液对金属具有腐蚀作用，因此不能使用。

（10）当使用固定角离心转子时，必须小心不能将离心管装得过满，否则会导致漏液。

（11）应当每天检查离心机内转子部位的腔壁是否被污染或弄脏。如污染明显，应重新评估离心操作规范。

（12）应当每天检查离心转子和离心桶是否有腐蚀或细微裂痕。

（13）每次使用后，要清除离心桶、转子和离心机腔的污染。

（14）使用后应当将离心桶倒置存放使平衡液流干。

（15）当使用离心机时，可能喷射出可在空气中传播的感染性颗粒。如果将离心机放置在传统的前开式的Ⅰ级或Ⅱ级生物安全柜内，这些粒子由于运动过快而不能被安全柜内的气流截留。而在Ⅲ级生物安全柜内封闭离心时，可以防止生成的气溶胶广泛扩散。但是，良好的离心操作技术和牢固加盖的离心管可以提供足够的保护，以防止感染性气溶胶和可扩散粒子的产生。

3．匀浆器、摇床、搅拌器和超声处理器的使用规范

（1）实验室不能使用家用（厨房）匀浆器，因为它们可能泄漏或释放气溶胶。使用实验室专用搅拌器和消化器更为安全。

（2）盖子、杯子或瓶子应当保持正常状态，没有裂缝或变形。盖子应能封盖严密，衬垫也应处于正常状态。

（3）在使用匀浆器、摇床和超声处理器时，容器内会产生压力，含有感染性物质的气溶胶就可能从盖子和容器间隙逸出。由于玻璃可能破碎而释放感染性物质并伤害操作者，建议使用塑料容器，尤其是聚四氟乙烯（PTFE）容器。

（4）使用匀浆器、摇床和超声处理器时，应该用一个结实透明的塑料箱覆盖设备，并在用完后消毒。可能的话，这些仪器可在生物安全柜内覆盖塑料罩进行操作。

（5）操作结束后，应在生物安全柜内打开容器。

（6）应对使用超声处理器的人员提供听力保护。

4．组织研磨器的使用规范

（1）拿玻璃研磨器时应戴上手套并用吸收性材料包住。塑料（聚四氟乙烯）研磨器更加安全。

（2）操作和打开组织研磨器时应当在生物安全柜内进行。

5．冰箱与冰柜的维护和使用

（1）冰箱、低温冰箱和干冰柜应当定期除霜和清洁，应清理出所有在储存过程中破碎的安瓿和试管等物品。清理时应戴厚橡胶手套并进行面部防护，清理后要对内表面进行消毒。

（2）储存在冰箱内的所有容器应当清楚地标明内装物品的科学名称、储存日期和储存者的姓名。未标明的或废旧物品应当高压灭菌并丢弃。

（3）应当保存一份冻存物品的清单。

（4）除非有防爆措施，否则冰箱内不能放置易燃溶液。冰箱门上应注明这一点。

（三）感染性材料的操作和防护规范

1．标本的安全操作

（1）标本容器

标本容器可以是玻璃的，但最好使用塑料制品。标本容器应当坚固，正确地用盖子或塞子盖好后应无泄漏。在容器外部不能有残留物。容器上应当正确地粘贴标签以便于识别。标本的要求或说明书不能够卷在容器外面，而是要分开放置，最好放置在防水的袋子里。

（2）标本在设施内的传递

为了避免意外泄漏或溢出，应当使用盒子等二级容器，并将其固定在架子上使装有标本的容器保持直立。二级容器可以是金属或塑料制品，应该可以耐高压灭菌或耐受化学消毒剂的作用。密封口最好有一个垫圈，要定期清除污染。

（3）标本接收

需要接收大量标本的实验室应当安排专门的房间或空间。

（4）标本包装打开

接收和打开标本的人员应当了解标本对身体健康的潜在危害，并接受过如何采用标准防护方法 的培训，尤其是处理破碎或泄漏的容器时更应如此。标本的内层容器要在生物安全柜内打开，并准备好消毒剂。

2．避免感染性物质扩散的方法

（1）为了避免被接种物洒落，微生物接种环的直径应为2～3mm 并完全封闭，柄的长度应小于6cm 以减小抖动。

（2）使用封闭式微型电加热器消毒接种环，能够避免在本生灯的明火上加热所引起的感染性物质爆溅。最好使用不需要再进行消毒的一次性接种环。

（3）干燥痰液标本时要注意避免生成气溶胶。

（4）准备高压灭菌和／或将被处理的废弃标本和培养物应当放置在防漏的容器内（如实验室废弃物袋）。在丢弃到废弃物盛器中以前，顶部要固定好（如采用高压灭菌胶带）。

（5）在每一阶段工作结束后，必须采用适当的消毒剂清除工作区的污染。

3．避免感染性物质的吸入以及与皮肤和眼睛的接触的规范

（1）微生物操作中释放的较大粒子和液滴（直径大于5μm） 会迅速沉降到工作台面和操作者的手上。实验室人员在操作时应戴一次性手套，并避免触摸口、眼及面部。

（2）不能在实验室内饮食和储存食品。

（3）在实验室里时，嘴里不应有东西——钢笔、铅笔、口香糖。

（4）不应在实验室化妆。

（5）在所有可能产生潜在感染性物质喷溅的操作过程中，操作人员应将面部、口和眼遮住或采取其他防护措施。

4．避免感染性物质接种的规范

（1） 通过认真练习和仔细操作，可以避免破损玻璃器皿的刺伤所引起的接种感染。应尽可能用塑料制品代替玻璃制品。

（2） 锐器损伤（如通过皮下注射针头、巴斯德玻璃吸管以及破碎的玻璃）可能引起意外注入感染性物质。

（3）以下两点可以减少针刺损伤：1） 减少使用注射器和针头（可用一些简单的工具来打开瓶塞，然后使用吸管取样而不用注射器和针头）；2）在必须使用注射器和针头时，采用锐器安全装置。

（4）不要重新给用过的注射器针头戴护套。一次性物品应丢弃在防∕耐穿透的带盖容器中。

（5）应当用巴斯德塑料吸管代替玻璃吸管。

5．血清分离的实验技术规范

（1） 只有经过严格培训的人员才能进行这项工作。

（2） 操作时应戴手套以及眼睛和黏膜的保护装置。

（3） 规范的实验操作技术可以避免或尽量减少喷溅和气溶胶的产生。血液和血清应当小心吸取，而不能倾倒。严禁用口吸液。

（4） 移液管使用后应完全浸入适当的消毒液中。移液管应在消毒液中浸泡适当的时间，然后再丢弃或灭菌清洗后重复使用。

（5） 带有血凝块等的废弃标本管，在加盖后应当放在适当的防漏容器内高压灭菌和／或焚烧。

（6）应备有适当的消毒剂来清洗喷溅和溢出标本。

6．开启装有冻干感染性物质安瓿的技术规范

装有冻干物的安瓿，因为其内部可能处于负压，突然冲入的空气可能使一些物质扩散进入空气。安瓿应该在生物安全柜内打开，应按下列步骤打开安瓿：

（1）首先清除安瓿外表面的污染。

（2）如果管内有棉花或纤维塞，可以在管上*近棉花或纤维塞的中部锉一痕迹。

（3）用一团酒精浸泡的棉花将安瓿包起来以保护双手，然后手持安瓿从标记的锉痕处打开。将顶部小心移去并按污染材料处理。

（4）如果塞子仍然在安瓿上，用消毒镊子除去。

（5）缓慢向安瓿中加入液体来重悬冻干物，避免出现泡沫。

7．装有感染性物质安瓿的储存规范

装有感染性物质的安瓿不能浸入液氮中，因为这样会造成有裂痕或密封不严的安瓿在取出时破碎或爆炸。如果需要低温保存，安瓿应当储存在液氮上面的气相中。此外，感染性物质应储存在低温冰箱或干冰中。当从冷藏处取出安瓿时，实验室工作人员应当进行眼睛和手的防护。

以这种方式储存的安瓿在取出时应对外表面进行消毒。

8．血液和其他体液、组织及排泄物的标准防护方法

（1）标本的收集、标记和运输

1）始终遵循标准防护方法；所有操作均要戴手套。

2）应当由受过培训的人员来采集病人或动物的血样。

3）在静脉抽血时，应当使用一次性的安全真空采血管取代传统的针头和注射器，因为这样可以使血液直接采集到带塞的运输管和／或培养管中。用完后自动废弃针头。

4）装有标本的试管应置于适当容器中运至实验室，在实验室内部转运也应如此。检验申请单应当分开放置在防水袋或信封内。

5）接收人员不应打开这些袋子。

（2）打开标本管和取样

1）应当在生物安全柜内打开标本管。

2）必须戴手套， 并建议对眼睛和黏膜进行保护（护目镜或面罩）。

3）在防护衣外面要再穿上塑料围裙。

4）打开标本管时，应用纸或纱布抓住塞子以防止喷溅。

（3）玻璃器皿和“锐器”

1）尽可能用塑料制品代替玻璃制品。只能用实验室级别（硼硅酸盐）的玻璃，任何破碎或有裂痕的玻璃制品均应丢弃。

2）不能将皮下注射针作为移液管使用。

（4）用于显微镜观察的盖玻片和涂片的操作

用于显微镜观察的血液、唾液和粪便标本在固定和染色时，不必杀死涂片上的所有微生物和病毒。应当用镊子拿取这些东西，妥善储存，并经清除污染和／或高压灭菌后再丢弃。

（5）组织标本的操作

1）组织标本应用福尔马林固定。

2）应当避免冰冻切片。如果必须进行冰冻切片，应当罩住冰冻机，操作者要戴安全防护面罩。清除污染时，仪器的温度要升至20℃。

（6）清除污染的方法

建议使用次氯酸盐和高级别的消毒剂来清除污染。一般情况可使用新鲜配制的含有效氯1g/L 的次氯酸盐溶液，处理溢出的血液时，有效氯浓度应达到5g/L 。戊二醛可以用于清除表面污染。

（7）对可能含有朊蛋白物质的防护

朊蛋白（prion，也称作为“慢病毒”）不能被普通的实验室消毒和灭菌方法所灭活，应当遵循以下防护措施：

1）使用专用仪器设备，即不与其他实验室共用仪器。

2）穿戴一次性防护服（隔离衣和围裙）和手套。

3）使用一次性塑料制品，它们可按干废弃物处理并丢弃。

4）由于灭菌的问题不能使用组织处理机（tissue processors）， 应当使用广口瓶或烧杯（塑料材质）替代。

5）所有操作必须在生物安全柜中进行。

6）必须特别小心以避免产生气溶胶、意外食入、划伤或刺伤皮肤。

7）福尔马林固定的组织，即使在长时间福尔马林的浸泡后，仍应视作具有感染性。

8）含有朊蛋白的组织标本暴露于96%甲酸1 h 可以基本失活[24, 25]。

9）实验台垃圾，包括一次性手套、隔离衣和围裙，均应当采用多孔负荷蒸汽灭菌器在134～137 ℃高压灭菌18 min 一个循环，或高压灭菌3 min 六个循环，然后再焚烧。

10）钢丝网手套或Kevlar 手套等非一次性用具，均必须收集起来清除污染。

11）污染有朊蛋白的感染性废液应当用含20g/L（2%）有效氯的次氯酸钠（终浓度）处理1 h。

12）多聚甲醛熏蒸的方法不能降低朊蛋白的滴度，朊蛋白对紫外线照射也具有抵抗力。但是，安全柜仍必须用标准方法来清除污染（如甲醛蒸气），以灭活可能存在的其他微生物因子。

13）朊蛋白污染的生物安全柜和其他表面可以采用含20g/L（2%） 有效氯的次氯酸钠处理1 h 来清除污染。

14）HEPA过滤器摘除后需要在至少1000℃ 的温度下焚烧。

15）用具应当用含20g/L（2%） 有效氯的次氯酸钠浸泡1 h，然后用水彻底清洗再进行高压灭菌。

16）不能高压灭菌的用具可以反复用含20g/L（2%）有效氯的次氯酸钠润湿超过1h 来进行清洁，并要求用水冲洗以清除残留的次氯酸钠。