妍妍丫丫 我是YY啊 2024-05-09 17:36 山东
电泳技术基于电泳的基本原理，受到电泳颗粒内部因素和电场外部因素的影响。基本原理
物质分子在正常情况下一般不带电荷，即所带正负电荷量相等，显示为电中性。但是由于其自身的解离作用或在其表面上吸附其他带电粒子而带上负电荷或正电荷，该物质在电场中便会向正极或负极泳动。带电物质颗粒种类很多，可以是离子，也可以为生物大分子，例如蛋白质、核酸、病毒颗粒甚至是细胞器等。蛋白质分子是由氨基酸组成的，氨基酸是典型的两性电解质，在溶液中可解离为带正电荷的氨基（—NH3+）和带负电荷的羧基（—COO-）。蛋白质分子带电的性质和所带电荷的多少主要取决于其性质及溶液的离子强度（ionic strength,I）和pH。在某一特定的pH条件下，蛋白质分子的正负电荷数正好相等，蛋白质分子所带的净电荷为零，此时溶液的pH即为该蛋白质的等电点（isoelectric point,pI）。当溶液的pH=pI 时，蛋白质分子不带电荷，在电场中不移动；
当溶液的pH>pI 时，蛋白质分子带负电荷，向正极移动；
当溶液的pH <pI 时，蛋白质分子带正电荷，向负极移动。
核酸与蛋白质类似，也是两性电解质。DNA 和 RNA分子的多核苷酸链上既有酸性的磷酸基，又有碱性的碱基，但因其磷酸基的酸性比碱基的碱性强，故在中性或偏碱性的溶液中，核酸分子通常表现为酸性，带负电荷，在直流电场中向正极泳动。
影响因素
（一）内在因素
电泳速度与粒子本身特性相关，如电荷的正负和大小、粒子的大小和形状、解离趋势、两性性质、水化程度等。一般说来，粒子所带的净电荷愈多，颗粒愈小，形状愈接近球形，则在电场中粒子运动速度愈快；反之则愈慢。一般说来，线状双链 DNA 分子不存在影响电泳速度的复杂构象，在凝胶电泳中，其相对分子量的常用对数与电泳速度成反比关系；但质粒DNA电泳的速度受分子空间构象的影响较大，相同分子量的质粒 DNA电泳速度的相对快慢是：闭环型＞线型>半开环型。RNA分子是局部双螺旋结构的单链，故RNA 分子的电泳速度不仅取决于其分子的大小，而且主要取决于其空间构象。1.电场强度 电场强度越大，带电粒子受到的电场力越大，泳动速度越快，反之亦然。根据电场强度的差异，可将电泳分为两类：①常压电泳（2~10V/cm）：电压一般为100~500V。适合分离蛋白质、核酸等大分子物质，分离时间较长，从数小时到数天。
②高压电泳（50~200V/cm）：电压一般为2000~10000V。多用于分离小分子物质，如氨基酸、多肽、核苷酸、糖类等，所需电泳时间很短，甚至只需几分钟。2.溶液性质 主要包括电极缓冲液和样品液的pH、离子强度和介质黏度等。
（1）溶液的pH：电泳时必须采用缓冲液作为电极液，以保持稳定的溶液 pH。溶液的pH决定了带电粒子的解离程度；也决定了该物质所带电荷数的多少。对蛋白质、氨基酸、核酸等两性电解质而言，缓冲液的pH距待分离物质的pI越远，粒子所带的电荷越多，电泳速度也越快；反之则越慢。因此，选择合适的pH，使欲分离的物质所带的电荷数量有较大的差异，有利于电泳时彼此的分开。蛋白质电泳大多数采用pH为8.2~8.8 的巴比妥或硼酸缓冲液，此时血清蛋白一般带负电。核酸电泳时常采用以下三种缓冲体系之一：TAE 缓冲液［三羟甲基氨基甲烷（Tris）-乙酸-乙二胺四乙酸（EDTA）］、TBE 缓冲液（Tris-硼酸）或TPE缓冲液（Tris-磷酸）。DNA 分子在这些缓冲液中带负电。（2）溶液的离子强度：所有类型的离子所产生的净电力称为离子强度。离子强度的高低取决于离子电荷的总数，与其性质无关。溶液的离子强度越高，带电粒子泳动速度越慢；反之越快。其原因是带电粒子吸引带相反电荷的离子聚集于其周围，形成离子氛（ionic atmosphere）。离子氛降低了颗粒的带电量，增加了颗粒运动的阻力，从而降低电泳速度。而且离子强度太高，当大量的电流通过时产生的热量可致水分大量蒸发。但离子强度太低，会降低缓冲液的总浓度及缓冲容量，不易维持溶液的pH，从而影响颗粒的带电量，致使电流下降、扩散现象严重、电泳分辨力降低。电泳时一般选择溶液的离子强度为 0.02~0.20mol/L较适宜。（3）溶液黏度：前面已经提到粒子的电泳迁移率与溶液的介质黏度成反比关系。因此，溶液的黏度过小或过大，必然影响电泳速度的快慢。3.电渗作用 在电场中，溶液对于固体支持介质的相对移动称为电渗（electro-osmosis）。当支持介质不是绝对惰性物质时，常常使靠近支持介质的溶液相对带电，溶液移动的同时携带颗粒一起移动。因此，带电粒子的表观泳动速度是粒子本身泳动速度与溶液携带粒子泳动速度的矢量和，二者方向一致时加快粒子的泳动速度，方向相反时则降低粒子的泳动速度。
4.吸附作用 支持介质的表面对样品具有一定的吸附作用，可以滞留待分离的物质而降低电泳速度，从而导致样品的拖尾现象，降低分辨率。
5.焦耳热 电泳时因电流通过而产热，称为焦耳热，其值与电流强度的平方成正比。焦耳热可致缓冲溶液温度升高，介质黏度下降，分子运动加剧，分辨率下降。焦耳热过高时还会烧毁滤纸、融化琼脂糖凝胶或烧焦聚丙烯酰胺凝胶支持介质。可通过控制电压或电流，或者采用安装冷却散热装置的措施，降低热效应对电泳的影响。
