• marker笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀的划平行线（线要直），各水平线间的间距为0.5-1cm，每孔至少画5条水平线，方便之后镜下观察每个区域

【划线时注意线不要太粗。】

• 用直尺比着，使用20ul枪头垂直于6孔板背后细胞划痕，使划痕与标记线相交，去除中央部分的细胞，形成若干交叉点，作为固定的检测点，以解决前后观察时位置不固定的问题，确保拍照观察点固定。【枪头要垂直，不要倾斜。尽量保证各个划痕宽度一致：不同孔之间最好使用同一只枪头，最好保持力度一致，尽量一次性划完。】

• 划痕完成后用显微镜照相，作为0h对照。

  
  

• 吸去旧培养基，再使用PBS洗细胞3次，洗去划下的细胞，使留下的间隙肉眼即清晰可见。

【用PBS缓冲液冲洗时，注意贴壁慢慢加入，以免冲散单层贴壁细胞；反复多次冲洗，尽量洗掉所有的细胞碎片，否则会影响拍照效果。】

• 然后加入新鲜无血清培养基。

【划出划痕后，把培养基换成无血清的培养基（有的细胞对无血清不耐受，可以少加点血清，维持细胞的状态），可以降低增殖对实验结果的影响。虽然无血清培养可以忽略细胞增殖的影响，但是由于细胞内信号传导系统整体性的下调节，细胞迁移的速度也会慢很多。】

• 根据需要设加实验组、对照组。不需加药的空白对照组只需添加等量的无血清培养基即可，药物干预组加入含药物的无血清培养基。

【划痕缩小是细胞迁移和细胞繁殖共同作用的结果，而不是单纯的细胞迁移。如果你要单纯的考虑细胞迁移，可以先用丝裂霉素（1μg/ml）处理1h，抑制细胞的分裂，这样结果就是细胞迁移的作用了。】

• 将细胞放入37℃，5%CO2培养箱中培养。然后在适当的时间点（根据个人实验需要）取出细胞，在显微镜下观察划痕宽度并拍照。

【一般按0，6，12，24小时拍照，建议不要把观察时间设置的太长，因为很容易造成细胞污染死亡或者过度增殖造成的假阳性结果。】

• 以预先做好的标记为定点观测点来进行定时拍照

【选择处理/对照组迁移能力差异明显的时间点拍照，拍摄与0h拍照时的相同位置，放大倍数相同。拍照时标记线不要出现在视野内，而是刚好沿着标记线的边拍照。细胞生长具有边缘效应，所以边缘细胞生长状态可能与中间的细胞不太一样，不宜作为观测点。】

• 数据处理：细胞迁移距离

结果分析：每个时间点的距离长度— 0h距离= 每个时间长度细胞整体迁移的距离，求出均数和标准差，时间为横轴，迁移距离为纵轴（单位mm）作图，并比较初始0h与实验结束时实验组与对照组的照片。