酶联免疫吸附测定（Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay，ELISA）是免疫学和分子生物学中广泛使用的实验室技术，由Eva Engvall和 Peter Perlmann 于1971年首次描述。该测定依赖于抗原-抗体相互作用的原理，并利用酶和比色检测来量化目标分子，主要用于检测和量化生物样品中特定蛋白质、肽、抗体或抗原的存在。ELISA测定通常应用于各个领域，包括临床诊断、药物研究和生命科学基础研究。
ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。
ELISA原理图及分类：
包括直接法、间接法、竞争法、双抗体夹心法，其中间接法和双抗体夹心法应用比常用。
直接ELISA：抗原通过一段时间的孵育被动地附着在塑料固相载体上，经过简单的洗涤后，通过添加与酶共价连接的抗体来检测抗原。孵育和洗涤后，通过添加色原/底物使酶活性产生颜色变化来显色。在规定的时间后通过化学手段终止酶活性后读取显色情况。在分光光度计中读取颜色。该方法相对简单，但它在灵敏度方面可能存在局限性，特别是当抗体-抗原相互作用相对较弱时。
间接ELISA（最常用方法）：间接ELISA是在直接ELISA的基础上添加酶标二抗进行检测。抗原通过孵育被动附着到孔上，洗涤后，将抗原特异性抗体（一抗）与抗原一起孵育。清洗孔并通过添加与酶共价连接的抗物种抗体（二抗）来检测结合的抗体。二抗对于产生所添加的第一抗体的物种具有特异性。
竞争性ELISA：在竞争性ELISA中，固定量的标记抗原与样品抗原（样本）竞争与固定化抗体的结合。信号与样品中抗原的浓度成反比。
夹心ELISA：将捕获抗原的抗体（捕获抗体）附着在固相载体上，洗掉多余的未结合抗体后，添加抗原并被特异性捕获，通过直接ELISA或间接ELISA的形式检测抗原。这种组合进一步提高了检测的灵敏度和特异性，是最常见的ELISA实验形式。
一、实验主要试剂配置（可以直接购买）：
1、ELISA实验包被缓冲液(PH 9.6 0.05M碳酸盐缓冲液)：
NaHCO3 1.59g；NaHCO3 2.93g；加蒸馏水至 1000ml
2、ELISA实验洗涤缓冲液(PH7.4 PBS)：0.15M
KH2PO4 0.2g；Na2HPO4·12H2O 2.9g；NaCl 8g；KCl 0.2g；Tween-20 0.05% 0.5ml；加蒸馏水至 1000ml
3、ELISA实验稀释液：
牛血清白蛋白(BSA) 0.1g；加洗涤缓冲液至 100ml
4、ELISA实验终止液(2M H2SO4)：
蒸馏水178.3ml，逐滴加入浓硫酸98%、 21.7ml。
5、ELISA底物缓冲液(PH5.0磷酸棗柠檬酸)：
0.2M Na2HPO4(28.4g/L) 25.7ml；0.1M 柠檬酸(19.2g/L) 24.3ml；加蒸馏水50ml
6、ELISA实验TMB(四甲基联b胺)使用液：
TMB(10mg/5ml无水乙醇) 0.5ml；底物缓冲液(PH5.5) 10ml；0.75%H2O2 32μl
7、ELISA实验ABTS使用液：
ABTS 0.5mg；底物缓冲液(PH5.5) 1ml；3%H2O2 2μl
8、ELISA实验封闭液：
牛血清白蛋白(BSA) 5g；加洗涤缓冲液至 100ml
二、实验步骤（主要是间接和夹心法）：
方法一 用于检测未知抗原的双抗体夹心法:
1. 包被：用0.05M PH9.包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg/ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。
2. 加样：加一定稀释的待检样品0.1ml（具体浓度需要预实验确定）于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。
3. 孵育：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37℃孵育0.5～1小时，洗涤。
4. 显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。
5. 终止：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。
6. 检测：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测OD值：在酶标仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。
方法二 用于检测未知抗体的间接法：
用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg/ml，每孔加0.1ml，4℃过夜。次日洗涤3次。加一定稀释的待检样品(未知抗体)0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时,洗涤。(同时做空白、阴性及阳性孔对照)于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体(抗抗体)0.1ml，37℃孵育30-60分钟，洗涤,最后一遍用DDW洗涤。其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。
