光镜基础知识 | 光与颜色

光的波长性是理解颜色、偏振、衍射、图像形成的物理基础。眼-脑视觉系统负责检测光，包括感知颜色和光强度的差异，我们将这种差异称为对比度。从光学意义上看，眼睛也是一个设计精巧的探测器，视网膜上感光细胞的间距，完全符合透镜形成的最精细图像细节的要求。光的特性对于选择滤光片和物镜、解释颜色、进行弱光成像以及许多其他工作都非常重要。

1 光是物质的探测器

将光视为一种探针的概念，用来理解显微镜下观察到的物体的结构，非常有帮助。一般来说，探针的尺寸必须小于或与被检测的结构（细节）相似，比如手指是确定计算机键盘上按键尺寸和形状的绝佳探针，但却无法确定计算机集成电路芯片上的布线模式。同样，光波能有效地分辨出尺寸与光波长相近的物体细节，但通常不能很好地分辨出尺寸与光波长相近的分子和原子结构。

图1人眼的结构。眼睛的角膜和晶状体，将放大的实像聚焦在视网膜上。眼睛显微系统的光圈平面位于晶状体前方的瞳孔中，起着可变光阑的作用。视网膜表面覆盖着大量杆状细胞。3 毫米的黄斑或黄斑上有一个直径为 0.5 毫米的眼窝，这是一个凹陷的坑，包含了视网膜上负责色觉的大部分视锥细胞。

可见光是一种叫做电磁辐射的能量形式，这种能量包含在称为光子的离散单元或量子中，具有粒子和波的特性。光子作为电磁波表现出振荡的电场和磁场，分别称为 E和B，其振幅和方向由矢量表示，在两个相互垂直的平面上以正弦波的相位振荡（图2）。

图2 光是一种电磁波。光波具有电场（E）和磁场（B），其振幅在空间和时间维度上呈正弦函数振荡。特定瞬间或位置的电场和磁场分量的振幅被描述为矢量，它们在两个相互垂直且垂直于传播方向的平面上振动。然而，在任何给定的时间或距离，E和B向量的振幅和相位都是相等的。为了方便起见，通常在图表中只显示波的电场矢量（E矢量），而不对其进行具体说明。

光子具有特定的能量，这决定了其波长（纳米）和振动频率（周期/秒）。重要的是要认识到，我们所感知的光电磁波（400-750nm）只是整个电磁波谱的一小部分，其范围从10⁴ m（无线电波）到10^-10 m（γ射线）（图3）。图3还将细胞、分子和原子的大小与不同辐射的波长进行了比较。

虽然光无法用单一的物理实体来定义，这一点令人沮丧，但我们可以通过数学关系来描述光的粒子和波的双重特性。能量、频率和波长的特性通过以下等式联系起来，可用来确定与特定波长的光子相关的能量：

c = νλ、E = hν

所以E = hc/λ

其中，c是光速（3 × 10¹⁰厘米/秒），ν 是频率（周期/秒），λ 是波长（厘米），E是能量，h是普朗克常数。

c = νλ将光速定义为频率与波长的乘积。我们会遇到速度和波长不同的情况，例如光进入玻璃透镜时。

E = hν将频率和能量联系起来，当我们必须选择波长来检查活细胞时，这个等式就变得非常重要。

E = hc/λ将光子的能量与其波长联系起来。由于 E∼1/λ，因此400纳米紫外线的能量是800纳米红外线的两倍。

图 3电磁波谱。图中显示了一个对数距离标尺（范围为 1 毫米至 0.1 纳米）。一边显示的是常见电磁辐射的波长范围；另一边显示的是各种细胞和大分子的大小。因此，一个红细胞（7.5 微米）的大小是可见绿光波长（500 纳米）的15倍。此外，还标出了眼睛、光学显微镜和电子显微镜的分辨率极限（*）。眼睛的分辨率极限（0.1毫米）是指在明亮照明条件下，将一张纸放在眼睛前方25厘米处，纸上黑白条纹交替出现的最小间隔。请注意，可见光的波长范围只占光谱的一小部分。

2 光的粒子和波的双重性质

在大多数情况下，我们会提到光的波性和光的传播。

电磁辐射是特定波长的平面波面在空间的运动。在空气、玻璃或真空等均质介质中，传播矢量是线性的。我们体验到的光子能量（和相应频率）光谱相对较窄，能够激发视网膜上视杆细胞和视锥细胞中的视觉色素，波长范围从400 nm（紫）到 750 nm（红）。

图4 作为 (a) 量子、(b) 波、(c) 矢量和 (d) 作为射线的光

如图 4所示，我们用不同的方式来描述光，这取决于我们想要强调的特征：

-作为电磁辐射的量子（光子），光子在电荷耦合器件（CCD）照相机或光电倍增管等定量测量设备的表面上作为单个能量量子（光电子）被检测到。

- 作为波，光子的传播被形象地描述为一对电场（E）和磁场（B），它们作为正弦波的函数在两个相互垂直的平面上相位振荡。代表这些场的矢量在两个相互垂直且垂直于传播方向的平面上振动。为方便起见，通常在图形和图表中只显示波的电场矢量（E-vector），而不作具体说明。

在x和y坐标图上显示正弦波时，y 轴上的波幅表示电场或磁场的强度，而x轴则表示波的传播时间或距离，或相对于其他参考波的相位。在任何给定的时间或距离内，电场和磁场矢量的振幅和相位都是相等的。从x轴（传播轴）向下看，E场矢量的平面可以在围绕该轴旋转360°的过程中以任何方向振动。E向量沿其传播轴和相对于某个固定参照物的角度倾斜称为方位角。通常，在图纸中看到的正弦波指的是一束光（由光子流组成的光束）的平均振幅和相位，而不是单个电磁波的特性。

-作为矢量，矢量长度代表波幅，矢量角度代表波相对于假想参照物的前进或后退。矢量角是相对于通过圆的焦点画出的垂直线定义的，360° 的旋转相当于一个波长（2πradians）。

- 作为光线或光束，光线（光束或光子流）在均质介质中的线性路径表示为一条直线。这种表示法常用于几何光学和光线追踪，以显示光线穿过成像系统透镜的路径。

3 光的性质

作为光学显微镜中的一种分析探针，我们还可以根据光的均匀度来描述光的种类或性质。

本文中最常提到的光的种类包括

光与物质相互作用的方式多种多样。入射到物体上的光可能会被吸收、透射、反射或衍射，这些物体被称为不透明、透明、反射或散射物体。

光可能被吸收，然后以可见光或热能的形式重新发射出去，也可能被转化为其他能量，如化学能。根据再发射所需的时间，瞬时吸收光并迅速以波长较长的光再发射的物体或分子被描述为磷光体或荧光体。被吸收的光能也可能在长红外线波长下缓慢再辐射，并可能被感知为热量。如果光能足以破坏分子内的共价键或驱动不良化学反应（包括形成细胞毒性自由基的化学反应），则细胞吸收的光可能具有破坏性。

最后，一束光在通过透明物体（如具有不同折射率的玻璃透镜）时可能会弯曲或偏离（折射），也可能在大型不透明物体的边缘均匀地弯曲（衍射），甚至被尺寸与光波长本身相似的小颗粒和结构散射（也称为衍射）。试样中的小结构元素对光的衍射是光显微镜中图像形成的主要过程。

图5 描绘光质变化的八种波形

4 眼睛如何感知光?

眼脑系统能感知光强度和波长（颜色）的差异，但看不到光的相位或偏振状态的差异。因此，既相干又偏振的激光无法与波长（颜色）相同的随机光区分开来。我们在此仅讨论对光强的感知，因为对颜色的感知将在下一节单独讨论。

光波的亮度在物理和光学上是用其E向量的振幅（A）来描述的，如其正弦函数图所示。事实上，正弦波的振幅在文中的许多图中都有显示。然而，视网膜上感光细胞的神经活动与光强度（I）成正比，光强度被定义为单位面积和单位时间内穿过探测器表面的光能流动率。振幅（能量）和强度（能量通量）之间的关系是：波的强度与其振幅的平方成正比，即

I ∝ A 2 .

要感知一个物体，该物体对应的光强必须是与附近的强度不同，从而表现出对比度，其中对比度定义为强度比:

C I = ΔI /Ib,

ΔI 是物体与其背景之间的强度差，Ib 是背景的强度。如果C = 0，物体就是不可见的（就像许多透明的显微镜标本一样）。更具体地说，可见度要求物体超过一定的对比度阈值。在明亮的光线下，视觉检测所需的对比度阈值可能只有 2-5%，但要看清物体，对比度阈值应是该值的许多倍。在昏暗的光线下，对比度阈值可能是 200-300%，具体取决于物体的大小。对比度一词总是指两个强度之比，是常用的术语。

5 视觉感知和色彩的物理基础

正如我们强调的，眼睛能看到光强度（对比度）的差异，并能感知不同波长的颜色，但无法分辨不同波长之间的相位差，也无法检测到偏振状态的差异。被感知为颜色的波长范围从 400 nm（紫光）到 750 nm（红光），而在强光下的灵敏度峰值出现在 555 nm（黄绿光）处。

图6中的曲线显示了眼睛在暗光（夜视）和亮光（日视）条件下对不同波长光线的反应。眼睛本身实际上是一个探测器，它能让我们在同一视觉场景中同时看到明亮和暗淡的物体。因此，两个物体 I1和I2 之间的明显强度差异被认为是强度比的对数，即log10(I1/I2)。有趣的是，这种关系是希帕克斯（Hipparchus，公元前160-127年）用来描述恒星等级的刻度所固有的，该刻度分为六级，每级有五个相等的亮度间隔。

今天，我们仍在使用这一标度，即希帕克斯恒星等级的五个等阶涵盖了100 的亮度差，这表明我们所认为的等强度步长实际上是强度比的对数。在强光条件下，眼睛的灵敏度在一个视野内大约覆盖三个数量级；但是，如果我们留出生理适应的时间，同时考虑昏暗和明亮的照明条件，就会发现眼睛的灵敏度范围总体上覆盖了令人难以置信的10个数量级。

图6 眼睛在夜视和日视时的光谱响应。这两条曲线的峰值灵敏度被归一化为1.0；然而，夜视（视杆细胞）的灵敏度是日视（视锥细胞）的40倍。视杆细胞中的视紫红质和视锥细胞中的颜色受体色素具有不同最大值和光谱范围的作用光谱。

视网膜上感光杆和视锥细胞的形状和分布是根据光的物理参数和眼睛透镜系统的光学原理调整的，以达到最高的灵敏度和分辨率。也就是说，视锥细胞（在眼窝中负责感知颜色的细胞）的外节在视网膜平面上排列在一起，细胞间距为 1.0-1.5 微米，约为视网膜上聚焦光点最小光斑直径（3 微米）半径的一半。1.5 微米的小锥状细胞直径使眼睛能够分辨结构细节，达到眼球透镜系统计算的理论极限。对于眼睛前方 25 厘米处的物体，这相当于0.1毫米的间距。看来，大自然允许光感受细胞尽可能有效地利用光的物理学原理和透镜光学原理！

杆状细胞感光细胞占视网膜感光细胞的95%，在暗光下活跃，但不能感知颜色。图7显示了视网膜中杆体细胞的分布。视杆细胞含有感光蛋白质--视紫红质，而不是色觉所需的光视色素，它们所提供的暗光视觉被称为散光视觉。视杆细胞中的视紫红质是一种感光蛋白质，它与一种发色团--11-顺式视紫红质（一种类胡萝卜素，在受到刺激时会从顺式光异构化为反式光异构化）--共轭，并负责视杆细胞膜的电活动。杆状感光细胞的峰值灵敏度（510 纳米）位于视觉光谱的蓝绿区域。

图7 视网膜中视杆细胞和视锥细胞的分布。每平方毫米的细胞数相对于从晶状体看到的视网膜中央凹的角度绘制。视网膜中央凹的特点是视杆细胞稀少，视锥细胞丰富。盲点缺少感光细胞。

杆状细胞视觉对光刺激的敏感度大约是介导色觉的视锥细胞感受器的40倍。强光会迅速漂白视紫红质，导致在昏暗光线条件下暂时失明，但视紫红质会在 20-30分钟内逐渐异构化，之后杆状细胞受体的功能就会基本恢复。完全恢复可能需要几个小时甚至几天的时间。

为了避免视紫红质色素的光漂白，并保持对昏暗标本的高视觉灵敏度（使用偏振光或荧光光学仪器时很常见），您应该在暗室中进行观察。通常也会在黑暗的显微镜室中使用红光照明，因为红色波长漂白视紫红质的效率较低（参见图8，了解视觉色素吸收光谱的差异），但仍能让您看到操作设备和做笔记。

锥状细胞光感受器只占视网膜光感受器细胞的5%，几乎只存在于视网膜的中央小窝，这个直径 0.5 毫米的小窝负责感知颜色和视觉敏锐度。在强光条件下，以锥体功能为主的视觉称为畏光视觉。锥状细胞含有对红色、绿色或蓝色敏感的色素蛋白，这些蛋白也与11-顺式视网膜结合。彩色光视色素彼此高度同源，与杆状细胞的视紫红质有大约40%的氨基酸序列同源性（Nathans，1984）。图8显示了纯化的视紫红质和三种色素的吸收差异光谱。

图8 四种人类视觉色素的吸收差异光谱。这些色素在可见光谱的红色、绿色和蓝色区域显示出最大值。这些值接近于在体内对视杆细胞和视锥细胞所测得的值，并且证实了一个多世纪以前麦克斯韦的基于RGB的色觉理论。

6 红-绿-蓝三色系统：加色和减色

颜色可描述为特定波长光的加法或减法。当所有三种锥状细胞类型（红、绿、蓝）受到同样的刺激时，光就会被感知为白色，就像在阳光下观看一张不吸收光的白纸一样。一个多世纪前，James ClerkMaxwell（1831-1879 年）发现，色觉可以通过一个简单的三刺激系统来近似，该系统包括红、绿、蓝三色刺激。通过改变这三种颜色的相对强度，可产生光谱中从紫色到红色的所有颜色。

加色法是通过组合不同的颜色波长而产生的。使用三盏可聚焦的投影灯，每盏灯都配备了单色的红、绿、蓝玻璃纸滤光片（用于 RGB 颜色分析的那种），就可以制作出混合波长以产生正色的精美范例。如图9所示，可以将三个色盘投影到屏幕上并使其重叠。

相反，减色法是通过从混合了多种波长的白光中减去（吸收）特定波长的光而产生的。这就是确定颜料颜色的原理。例如，看起来是红色的颜料会吸收蓝光和绿光，但会反射红光，因此默认为红色。因此，在颜料中观察到的颜色是通过减色法产生的。令人着迷的是，黄色、青蓝色和品红色颜料分别由红色和绿色、绿色和蓝色以及蓝色和红色波长的等量混合物组成。

因此，对黄色的感知可以通过两种方式产生：(1) 单色黄色（580 纳米）光源同时刺激红色和绿色视锥细胞--红色和绿色光视色素表现出宽泛的激发光谱，在 580 纳米波段区域明显重叠，两者受到的刺激几乎相等；或 (2) 用不同波长的红色和绿色混合光分别刺激红色和绿色视锥细胞，每个波长选择性地刺激视网膜上的红色和绿色视锥细胞。

无论哪种方法，黄色都是指红色和绿色视觉色素同时受到刺激。对其他颜色的感知需要在不同程度上刺激一种、两种或所有三种视锥细胞类型。

将不同颜色的颜料混合以产生新的颜色，这是我们在制作颜色时的常见经验，实际上是一个减法过程。想想为什么黄色和蓝色颜料混合会产生绿色：黄色颜料（反射红色和绿色，但吸收蓝色）和蓝色颜料（反射蓝色和绿色，但吸收红色）混合会产生绿色，因为绿色是黄色和蓝色颜料混合后唯一反射而不吸收的波长。

因此，将蓝色和黄色波长的光结合在一起会产生白色，而将蓝色和黄色颜料混合在一起则会产生绿色！从视觉光谱中去除特定波长的光也是产生干涉色的机制。明纳特（Minnaert，1954）对观察自然现象时的色彩感知进行了有价值的概述。

图9 红-绿-蓝三色系统的附加色。如文中所述，通过三个独立的投影仪将 RGB 滤色片发出的光投射到屏幕上，就可以产生这种色彩显示效果。