2022年8月31日，华东师范大学生命科学学院、邦耀生物（BRL Medicine）及浙江大学医学院附属第一医院合作在Nature上发表了题为Non-viral, specifically targeted CAR-T cells achieve high safety and efficacy in B-NHL 的研究论文。该论文共同通讯作者刘明耀教授系海南医学院衰老与肿瘤国际研究中心（International Center for Aging and Cancer, ICAC）基因细胞治疗和创新药物研究实验室主任。该论文首次报道了一种创新性非病毒定点整合CAR-T技术的开发及其治疗复发难治性非霍奇金淋巴瘤的临床试验结果。该技术可以在不使用病毒载体的情况下，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术将CAR序列定点插入到T细胞基因组的特定位点，一步实现CAR稳定整合和内源基因调控，有效解决了目前CAR-T技术存在的使用病毒和随机插入这两大问题。

CAR-T技术可以在不使用病毒载体的情况下，通过基因编辑工具 CRISPR/ Cas9将 CAR 定点整合到 PD1 位点，生成治疗用的 CAR-T 细胞，相当于 PD1 抗体和 CAR-T 联合治疗，显著提高了治疗疾病的安全性和有效性。PD-L1/PD1信号通路是抑制T细胞功能的重要免疫检查点，目前针对PD-L1/PD1的抑制剂已经在多种类型的恶性肿瘤中取得了良好的疗效，也有不少研究报道了PD1敲除可以有效增强CAR-T细胞的功能。因此，研究人员进一步制备了靶向CD19非病毒PD1定点整合CAR-T细胞（PD1-19bbz），并开展了系统的研究。在PD1位点，CAR序列的平均整合效率可达20%左右，最高为30.3%。与之前报道相一致，PD1下调并不会影响CAR-T细胞响应肿瘤靶细胞后表面标志物表达和细胞因子分泌。为了更好地研究PD1-19bbz的功能，研究人员采用慢病毒感染结合基因编辑的方法制备了PD1敲除的CAR-T细胞（LV-19bbz_PD1-KO），并与LV-19bbz、AAVS1-19bbz和PD1-19bbz进行了平行比较。在小鼠体内肿瘤杀伤实验中，相比于其他组别，PD1-19bbz无论在PD-L1高表达还是低表达的肿瘤细胞中，都体现出更强大、更持久的杀伤效果，小鼠生存率得到显著提高。团队进一步开展临床研究，结果表明，在接受治疗患者中未观察到CAR-T治疗相关的神经毒性和2级以上的细胞因子释放综合征，证明PD1-19bbz CAR-T细胞具有出色的临床安全性。用PCR技术和流式细胞术方法检测发现PD1-19bbz CAR-T细胞在患者体内可获得快速扩增和长时间的维持。在难治复发淋巴瘤患者中，客观缓解率（Objective Remission Rate, ORR）高达100%，完全缓解率（Complete Remission Rate, CRR）达到87.5%。进一步利用单细胞测序技术研究PD1-19bbz CAR-T细胞体内作用机制，结果表明PD1-19bbz CAR-T细胞产品中存在高比例的记忆性T细胞，体内PD1-19bbz CAR-T细胞具有更强的杀伤肿瘤作用，长期存续的CAR-T细胞具有记忆性细胞的特征。这也全面阐明了非病毒PD1定点整合CAR-T细胞优越的临床疗效背后的作用机制。

与病毒制备 CAR-T 的方式相比，这种方式制备时间更短，制备工艺也更简单，一步电转即可完成重编程；无需病毒，成本大幅降低，同时也减少了用病毒可能的潜在风险；临床上 CAR 表达均一，毒副作用小，没有 3 级及以上细胞因子风暴和神经毒性；更重要的是，临床疗效更好，相当于 CAR-T 和 PD1 抗体的联合治疗，ORR 为 100%, CRR 为 86.7%。这一创新技术为未来更多基因靶向修饰CAR- T疗法的发展奠定了坚实的基础，对衰老与肿瘤的发展具有重要的推动作用。

衰老是肿瘤、心血管、神经系统等疾病最重要的发病及不良预后因素。因衰老带来的疾病目前已成为阻碍社会健康水平提升的关键因素，给经济增长与社会保障带来严峻挑战。深入认识衰老、及早干预衰老进程、有效减少因衰老导致的慢性疾病及提高老年人生活质量已成为现代生物医学研究的重要领域。

ICAC的使命是致力于通过创新性实验室研究、转化研究及临床研究增进对衰老和肿瘤的认知，以应对日益严重的全球老龄化问题和与衰老密切相关的癌症高发带来的日益严峻的全球健康挑战，非病毒定点整合CAR-T技术将在ICAC开展更广泛深入的临床试验，让更多肿瘤患者受益。