Western Blot原理及流程（3）-海南省热带心血管病研究重点实验室-海南医科大学

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日期：2021-03-19 点击数：

转膜

1、根据 maker 的指示，分别切出对应需要分子量蛋白的胶；并用尺子量取胶的宽度；

2、准备6张与胶同样大小的滤纸和1张NC膜一起放入转膜缓冲液中，至完全浸透。使用PVDF膜需要用甲醇激活。

3、按照3张滤纸，膜，胶，3张滤纸的顺序依次放好，要求中间没有气泡。将电泳夹轻轻夹紧，放入电泳仪中，要求胶靠近负极（电泳仪中的黑色一面）膜靠近正极（电泳仪中红色一面），倒入电泳缓冲液没过有胶的地方。

4、盖上电源盖，接通电源，转膜，不同的分子量转膜时间不同；（例如300mA，1h,20-25KD）

注意：

①黑面朝上，组装结构为：（黑）海绵—滤纸（2-3张）—胶—膜—滤纸（2-3张滤纸）—海绵（红or白）

②转模槽需埋入冰中，防止转膜过程中甲醇产热温度过高。

封闭

配制 5%脱脂牛奶，质量体积比为1g脱脂奶粉：20ml 1×TBST 。将转完后的膜用 5%脱脂牛奶封闭至少1h。

一抗孵育

1、配置抗体，稀释比例根据抗体说明书的要求配置，稀释液一般为一抗稀释液。

孵育时间根据季节温度变化，夏天：4℃过夜，第二天室温摇床30~60min，直至抗体温度为室温；

冬天：室温摇床 60min~180min，4℃过夜，第二天室温摇床60-120min，直至抗体恢复到室温。

2、洗膜 1×TBST 洗3次，5min一次。

二抗孵育

1、配置抗体，稀释液为 1×TBST，比例需根据说明书要求大概为 1:3000~1：4000。

孵育时间为，夏天：室温摇床 30-60min；冬天：室温摇床 60min-180min。

2、洗膜 1×TBST 洗3次，5min一次。

注意：一抗，二抗孵育洗膜时间可以灵活调整，一般3-5次，5min一次

显影曝光

1、试剂盒A液+B液现配现用（A:B=1:1），避光保存；

2、夹起膜放入玻璃皿中，吸显影液滴在膜上，确保显影液浸润到了膜所有地方；

3、image Lab曝光步骤：膜放置皿中（小口径玻璃皿中）—打开仪器（image lab）,膜放入机器—选择印迹—colorimetic—自动曝光—拍白光圈

4、曝光拍照（CHEMI）—选择“放置凝胶”——设置曝光时间（自动or手动）—凝胶成像—保存

注意：一抗原液（1:1000）稀释，若显影条带较暗可适当提高比例如1:500

Eg:5ul一抗原液+5000ul（5ml）一抗稀释液