近日，实验室成员夏乾峰教授联合南京大学化学化工学院鞠熀先教授在Sensors and Actuators: B. Chemical（IF=9.221）上发表了题为“A ratiometric fluorescent biosensor for rapid detection of Burkholderia pseudomallei by dual CRISPR/Cas12a trans-cleavage assisted signal enhancement”的类鼻疽杆菌检测新方法。海南医学院热带医学院林英姿教授和研究生林寿佳为共同第一作者。

 由类鼻疽伯克霍尔德菌(Bp)感染引起的类鼻疽病在热带和亚热带地区具有高死亡率。急需一种快速、灵敏的检测方法。为此，本研究设计了基于Pdots和CRISPR/Cas12a信号增强的比例荧光传感器，用于Bp DNA的敏感检测。该传感器以TAMRA标记的DNA为探针，在酸性pH下吸附在聚合物点(Pdots)上，通过荧光共振能量转移(FRET)在Pdots的激发波长产生TAMRA荧光。在目标DNA存在的情况下，双重识别位点激活了CRISPR/Cas12a的反式切割活性，从而剪切探针DNA以降低FRET效率。以Pdots与TAMRA的荧光比值为检测信号，实现了比值荧光生物传感。

原理图. 基于Pdots的双CRISPR/Cas12a辅助信号增强比率荧光生物传感策略示意图。(A) PFBT Pdots的合成过程。(B) TAMRA-DNA在Pdots上的酸性吸附产生FRET过程。(C) pH调节的Cas12a辅助比例荧光生物传感技术用于Bp的双识别位点检测。

 该方法在Bp核酸序列中设计了两个CRISPR/Cas12a的识别位点，增加了Cas12a的反式切割作用位点，缩短检测时间，减少Bp基因组突变造成的漏检，提供了更高容错率的检测平台。采用HCl灭活代替传统加热灭活，可在无加热设备的环境中快速终止反应。该策略使用吸附代替传统的共价偶联构建TAMRA-Pdots比率荧光传感器，解决了共价偶联存在表面生物分子数量难以控制和在界面反应中靶标与Cas12a存在空间位阻的问题。利用Pdots的优异荧光亮度Cas12a的反式切割辅助信号增强技术，提高类鼻疽杆菌传感器的检测重复性和灵敏度。该传感器可在40 min内检测到1.0 pM ~ 10 nM 的Bp 靶标dsDNA，并成功用于Bp 核酸提取物的直接检测。该方法具有灵敏度高、特异性好、准确度高、分析时间短、操作方便等优点，在类鼻疽的临床诊断中具有应用潜力。