A general strategy to develop fluorogenic polymethine dyes for bioimaging

一种用于生物成像的荧光聚甲炔染料的通用开发策略

论文信息：nature chemistry   IF：19.2

Date : 2023年11月27日 , DOI: https://doi.org/10.1038/s41557-023-01367-y

主讲人：刘梦月，2025年9月19日

研究背景

1.荧光成像技术的重要性：

荧光成像是研究生物过程的宝贵工具，它能够帮助科学家们观察细胞内的动态变化，了解细胞结构和功能。例如，通过荧光标记的蛋白质，可以追踪蛋白质在细胞内的位置和运动，从而揭示细胞内的信号传导、物质运输等过程。

2.荧光探针的现状与不足：

目前，荧光成像的发展依赖于先进的荧光探针，尤其是能够特异性标记细胞内目标的荧光探针。现有的荧光探针中，基于罗丹明（rhodamine）的荧光染料表现出色，但它们存在一些局限性。一方面，罗丹明染料的合成过程往往较长且产率较低；另一方面，它们的发射光谱主要集中在可见光范围内，对于一些需要更长波长（如近红外区域）的应用场景不够理想。

3.聚甲炔染料的优势与挑战：

聚甲炔染料是一类在细胞、组织和全生物体成像中广泛使用的荧光染料。它们具有合成简单、模块化程度高、摩尔消光系数大、生物相容性好以及发射波长可调等优点。然而，与罗丹明染料不同，聚甲炔染料本身没有一个可以用来诱导荧光产生的分子内环化平衡。尽管之前有研究尝试通过添加亲核侧链来使聚甲炔染料具有荧光诱导性，但这些尝试的效果并不理想，主要原因是环化反应的效率较低，无法像罗丹明染料那样实现高效的荧光转变。

研究意义与目的

   本文提出了一种将聚甲炔化合物转化为荧光探针的通用策略，通过分子内环化的方法实现。研究者们通过这种策略开发出了具有自发闪烁和无需洗涤、开启型荧光的聚甲炔染料，其发射光谱覆盖可见光到近红外区域。这些探针可以与自标记蛋白（如SNAP-tag）和小分子靶向配体结合，并且能够与基于罗丹明的染料一起用于多色和荧光寿命多路复用成像。与现有的罗丹明染料相比，这些新开发的聚甲炔染料具有更长波长的发射光，且合成过程更简单高效。

研究内容

荧光显微镜是研究细胞结构和功能的重要手段。荧光蛋白标签允许动态观察活细胞中的蛋白质，但它们的亮度和光稳定性往往不如那些小分子荧光团。HaloTag或SNAP-tag结合了小分子染料优异的光物理特性和基因编码标签的精确标记，已广泛应用于荧光显微镜和纳米显微镜。应用经典的有机化学启发式来设计有利的环化反应，从而产生用于活细胞成像的荧光花菁染料的一般策略。

探针设计与理论计算：一种有效的荧光染料必须完全以非荧光形式存在，除非它与预定的目标结合。在基于环化的荧光性的情况下，这意味着环打开和关闭的势垒必须分别高和低。极性环化反应的有利性可以使用称为Baldwin规则的启发式准则来估计。在过去创建荧光性花菁染料的尝试中，分子内环化是5-内三角型的，根据Baldwin规则，这是不利的。

  探针的细胞荧光成像为了验证这些计算预测：制备了吲哚构建块5、6、7a-d和连接体8。接下来，用微波辅助的两步合成了5-内三角Cy5探针2a和2b。5-外三角Cy5探针4a和4b通过甲酯中间体9a-d分两步制备，然后用LiAlH4还原(图2a)。对这些Cy5衍生物进行了pH滴定，以评估封闭异构体的稳定性。5-内三角探针的pH滴定显示，环开口pKa值高于生理pH (2a为11.1,2b为8.5)，表明这些探针作为细胞中的自由小分子具有高荧光性。

  Cy5衍生物在荧光细胞成像中的应用：应用5-外三角环闭合策略来开发一种免洗荧光Cy5衍生物。将9c的甲酯基转化为N-甲基酰胺12，并制备了相应的5-内三角吲哚啉13和Cy5探针14(图3a)。这些含炔衍生物与苄基鸟嘌呤10偶联，生成探针15和16(图3b)。这些染料与纯化的SNAP-tag蛋白孵育后，化合物15的吸光度增加了6倍，荧光增加了19倍。与SNAP-tag结合不仅诱导开环，而且与溶液中的游离染料相比，化合物15的发射量子产率也增加了。然而，认为可以利用这种相互作用进一步增加5-外三角聚甲基探针与手性靶标结合时的荧光性。

   Cy3和Cy Cy5衍生物在荧光细胞成像中的应用：探索了5-外三角荧光策略是否可以扩展到Cy3和Cy7染料，为两个额外的成像通道提供荧光团。怀疑Cy3的导数会比Cy5有更高的LUMO能量，而Cy7的导数则相反;因此，预计Cy3染料比Cy5染料更有可能采用开放形式，而Cy7染料则倾向于采用封闭形式。为了平衡这些趋势，在顶层吲哚上添加了CF3片段，以支持Cy3的封闭形式。同样，在Cy7设计中用缺电子酰胺取代亲核N-甲基酰胺，以促进开环。制备了Cy3衍生物19和Cy7衍生物20(图4a)用于snap标签标记。虽然信号不能通过波长来区分，但通过相量图分析，可以很容易地通过它们的平均激发态寿命来区分它们。

总结与展望：

   提出了一种通过5-外三角环闭合方法赋予花菁染料的一般策略。通过生成自发闪烁的Cy5染料、荧光性Cy3和Cy5染料以及明亮且光稳定的近红外荧光性Cy7，说明了荧光性聚甲基支架的潜力。Cy7衍生物探针20由于其高亮度和长发射波长而特别有趣。此外，发现这些探针可以用于无洗共聚焦活细胞显微镜和SMLM,它也可以与广泛使用的罗丹明-卤素标签缀合物结合在多色和多路寿命成像实验中使用。通过使用自标记蛋白标签SNAP-tag，以及jasplakinolide或Hoechst 33342染料来驱动荧光开启，证明了开启策略的通用性。内酰胺环与核酸中蛋白质或磷酸基团中普遍存在的酰胺之间的特定相互作用(例如氢键)可以触发开环。包括分子动力学模拟和位点定向诱变在内的更详细的研究可以进一步阐明特定5-外三角聚甲基染料的荧光开启机制。鉴于多甲基染料的高模块性，光谱范围可以进一步扩展到绿色以及短波红外(Cy9染料)波长。此外，多甲基染料的光物理性质和荧光性可以通过改变吲哚胺或连接体上的取代基来进一步调整。这种简单而通用的方法将用于开发改进的荧光探针，促进新的生物成像实验。