Real-time imaging of protein microenvironment changes in cells with rotor-based fluorescent amino acids
基于转子的荧光氨基酸实时成像细胞中蛋白质微环境变化
论文信息：Nature chemical biology，2025-09：1755-4330
主讲人：叶碧珊，2025年11月9日
研究背景：
蛋白质或其亚结构域的微环境变化可引发配体结合、蛋白质聚集、成簇化等过程，这些过程与细胞通路及多种人类疾病密切相关。因此监测这些蛋白质亚结构内的微环境变化，能为多种人类疾病提供重要见解，以及对新型治疗策略的开发提供指导。将环境敏感型荧光基团或荧光蛋白与目标蛋白融合的技术已被广泛应用于研究蛋白质微环境的变化。然而，这些技术通常需要在目标蛋白的N端或C端连接大体积荧光蛋白或标签，这可能干扰目标蛋白的正常功能，并限制其在高空间分辨率下检测微环境变化的能力。
研究内容：
基于转子的荧光团（rotor-based fluorophores, RBF）能够响应微环境粘度变化。在低粘度溶剂中，RBF荧光激发以非辐射方式耗散，随着环境粘度的增加，RBF的荧光发射强度也逐渐增强。本研究中，作者通过遗传密码扩展（genetic code expansion, GCE）技术将基于RBF的环境敏感型非天然氨基酸（noncanonical amino acids, ncAA）精确插入目标蛋白特定位点，实现对蛋白质亚结构微环境变化的实时监测。通过对氨酰-tRNA合成酶进行计算机辅助重构，作者成功在哺乳动物细胞中将转子型非天然氨基酸导入多种蛋白质中，实现在蛋白质聚集、成簇、簇解离等过程中检测特定残基周围微环境的动态变化。
要点：
在本工作中，研究团队以极性敏感荧光氨基酸 Anap 为骨架并通过引入旋转连接键及拉电子基团设计出一系列基于转子的荧光非天然氨基酸（RBF-ncAAs）。这类基于转子的非天然氨基酸对环境极性和黏度的变化具有高度敏感性。他们通过计算手段对氨酰-tRNA合成酶 (aaRS)进行重新设计，从而将发射波长最长、黏度敏感性最高的AnapTh以位点特异性方式通过基因编码整合到多种目标蛋白质中。当蛋白质发生聚集/聚类时，表面暴露残基的微环境黏度升高、极性降低，AnapTh 荧光增强；通过共聚焦显微镜可实时追踪特定残基周围的微环境动态。
研究团队探究了 RBF-nCAAs 的荧光性能，3 种 RBF-ncAAs 的发射波长随溶剂极性降低红移更显著，其中 AnapTh 在水 (高极性) 与 1,4 - 二氧六环 (非极性) 中发射位移超 100 nm ；基于 Forster-Hoffmann 方程计算，AnapTh 的黏度灵敏度最高，且在高黏度甘油中量子产率显著高于低黏度水 / 甲醇。接下来，作者对氨酰 -tRNA 合成酶 (aaRS) 进行计算重构，发现预测结构活性位点两个环与配体存在空间冲突。他们通过 LigandMPNN 计算设计突变体，经两轮筛选得到最优突变体 AnapThRS。通过共聚焦显微镜观测结果可知，在 HEK293T 细胞中，AnapThRS 介导的 EGFP-39AnapTh 表达量显著高于原始 AnapRS，且无明显细胞毒性。
hSOD1-A4V 突变会导致蛋白金属丢失后聚集，引发 ALS (关联肌萎缩侧索硬化症)。将 AnapTh 插入 hSOD1-A4V 的 6 个位点 (3 个表面暴露残基：Trp32、Asp92、His110；3 个内部残基：Val31、Phe45、Leu117)。当蛋白质发生聚集 / 聚类时，表面暴露残基的微环境黏度升高、极性降低，AnapTh 荧光增强。加入蛋白酶体抑制剂 MG132 后，表面暴露残基的 AnapTh 荧光强度提升 3 倍，出现聚集斑点；内部残基荧光无变化。加入 Hsp70 抑制剂 YM-1 后，聚集斑点消失，荧光强度恢复至未处理水平，证明监测的可逆性。
总结与展望：
1.实现了活细胞蛋白质微环境成像的技术突破，解决了传统技术的三大痛点：
克服标记干扰： 使用小分子氨基酸探针 取代庞大的荧光蛋白或标签，实现了最小化干扰的标记。
实现了位点特异性： 借助GCE技术，能将探针精准插入蛋白质内部的任何位点，而不仅仅是末端。
提供了功能读数： 所使用的AnapTh探针是环境敏感的，其荧光信号直接报告局部粘度和极性的物理化学变化，而非单纯的位置信息。
2.通过多系统证明其普适性与强大功能
hSOD1&Htt：代表了病理性蛋白质聚集与纤维化过程。研究表明，聚集过程对微环境的影响是高度异质性的，取决于残基在蛋白质中的具体位置。
STIM1&CRY2：代表了生理性的、功能性的蛋白质聚类过程。研究成功地将物理聚类与功能性构象变化区分开来，并揭示了信号传导中的关键构象重排。
3.局限性
并非万能标记：AnapTh不能安装在蛋白质的每一个位点。对于那些对蛋白质折叠、稳定性或功能至关重要的残基，进行替换会导致蛋白失活，因此无法研究。
需要位点筛选：在实际应用中，需要筛选合适的、能够容忍AnapTh替换且不影响蛋白功能的位点。
