概 览
3D打印技术在20世纪80年代由名古屋工业研究所的Hideo Kodama 以及三维系统公司的Chuck Hull发明之后，目前已经广泛应用于工业各个领域。3D打印又称增材制造(Additive Manufacturing, AM)或者积层制造。有别于于传统的工业加工技术， 比如切，削，磨等。3D打印是一个不断添加的过程，在计算机控制下层叠原材料。3D打印的优势包括快速成型，高度可定制化，费用低廉等，迅速在建筑、工业设计、汽车、 航空、环境、生物科技等领域高速发展。
“3D打印使得生产单个物品与批量生产几乎一样便宜，这就削弱了规模经济。它对社会影响的深远程度可能同1750年的蒸汽机，1450年的印刷机和1950年的晶体管一样，没人能轻易预料。它迅速发展着，对每个相关领域都产生着巨大的影响。”
—— 《经济学人》，2011年2月10日，领袖篇
在生物医药领域，3D打印已经被应用于生产移植器官和器械等，比如骨盆、下颌骨、关节、义肢等支撑结构。现在越来越多的科技公司和学界开始研究3D打印技术在组织工程和再生医学的应用，也就是用3D打印技术生产身体组织和器官。这也催生了在细分领域专业应用的3D生物打印机。
目前市面上绝大部分的3D生物打印机与传统3D打印机的技术类似，采用层积制造法，制造出细胞支架，再将细胞种入支架中使细胞生长。3D生物打印机与传统3D打印机最大的区别在于使用的材料，生物打印机利用生物墨水(bioink)而不是常用的塑料或者合金材料。打印出来的立体类似活体组织可以应用到组织工程和医药研发领域，比如药物测试，疗法筛选等。但是因为生物打印的组织器官缺乏比如血管或者肾小管等功能性单位，现阶段还非常难以培育成多细胞的完整器官用于临床应用。
3D生物打印过程一般分为3步：打印前准备、打印以及打印后处理。生物打印的准备工作包括创建打印结构模型以及选择打印材料。首先取得需打印器官的组织检体和医学影像。使用电脑断层(CT)和核磁共振(MRI)取得患者的医学影像，是最常见的方法。取得影像后，利用电脑软件(CAD)重建图像，检查及修正流形错误并转换成打印客户端可以识别的G代码文件。G代码文件定义了生物墨水的打印路径以及打印步骤需求。之后还需分离出预计要培养的细胞并加以增量。再把细胞和特殊的液态材料进行混合，这些材料会为细胞提供生长必须的氧气和营养物质。细胞增殖并不需要细胞支架。最后根据选择的材料和打印方法，细胞和基质的混合物被转移到对应的打印管道或者容器中。
图1
细胞、偶联物质和营养基质的混合物被称为生物墨水。生物墨水被打印机一层一层的精确按照事先定义的形状堆积到生物相容的支架上。通过3D生物打印制造的人造器官(例如肝脏和肾脏)已被证明缺乏影响身体的关键元素，例如工作血管、收集尿液的肾小管以及这些器官所需的数十亿细胞的生长。没有这些成分，身体就无法在其内部深处获取必需的营养物质和氧气。鉴于身体中的每个组织都是由不同类型的细胞自然组成的，不同的打印技术在确保细胞稳定性和活性的程度上差别很大。
生物打印后的维护过程对创建稳定的结构是非常必要的。如果没能很好的维持这个过程，3D打印物体的机械完整性和功能就会面临风险。必要的机械和化学刺激都是必须的。这些刺激向细胞发送信号以控制组织的重塑和生长。最近的生物反应器技术使打印的生物组织具备迅速成熟、组织血管化和移植后存活的能力。生物反应器的作用是提供对流养分运输、创造微重力环境、改变压力使溶液流过细胞等。每种类型的生物反应器都适用于不同类型的组织，例如机械压缩式生物反应器适用于软骨组织。
图2
生 物 墨 水
生物墨水是决定3D生物打印成功与否最重要的因素之一。理想的生物墨水应具有特定的物理化学性质，例如机械性能、流变学、化学和生物学特性等。这些特性需要使得最终打印产品可以：(i)产生具有足够机械强度的组织结构，以及稳定性，同时最好可以与组织结构匹配并可细调，以满足定制化需求；(ii)可调节的凝胶化特性和稳定性，以帮助实现形状结构的高保真度； (iii)生物相容性，如有必要，可模拟天然生物降解性组织的微环境； (iv)适合不同化学成分的调节以满足组织特异性需要； (v)最小的批次间差异，以进行大规模生产。
图3
这些要求决定了生物打印材料(生物墨水)和传统3D打印材料虽然打印方法类似，但是材料本身有很大的差别，生物墨水非常敏感。与传统的3D打印材料(如热塑性塑料)一旦打印就基本上“固定”不同，生物墨水是一个动态系统，因为它们的含水量高且通常是非晶体结构。生物墨水具体的要求细节包括(但不限于)：
必须能够在低得多的温度(37摄氏度及以下)打印；
更加温和的交联条件；
具备生物活性；
此外在使用挤压式打印机时必须考虑打印压力和喷嘴直径，以尽量减少在打印过程中施加在生物墨水和生物墨水内任何细胞上的剪切应力。过高的剪切应力可能会损坏或裂解细胞，从而对细胞活力产生不利影响。所以应用于挤压式打印机的生物墨水要求更复杂，包括(图4)：
等等。
图4
图5
对生物墨水的要求和完成实验的复杂程度很大程度上限制了生物打印机在不同应用的普及。英国斯旺西大学在2021年针对9720种不同材料的组合做了测试，发现只有123种组合可以适合生物打印。
生物墨水一般使用藻酸盐、脱细胞 ECM、明胶等材料创建。
打 印 技 术
虽然最新的断层体积式生物打印技术已经超出了传统打印技术的范畴，但是一般情况下生物3D打印技术被定义为使用计算机辅助传输过程，用层积的方式制造出设定的团并组装，以生产生物工程结构的技术。生物打印技术大致可以分为以下几类。
图6
挤出式打印技术(Extrusion bio-printing)。从打印机喷嘴用压力驱动的方式挤出用户自定义的细丝。
激光辅助光固化生物3D打印(Lithography bio-printing)。将光线集中到2D平面中以局部凝固水凝胶，然后通过机器转换层面，形成层层交联的3D结构。光刻生物打印的优势在于更高的分辨率和精确性，能够重现复杂的微结构。
微球打印技术(Spheroid bio-printing)。微球生物打印技术优势在于能提供高细胞密度结构的印刷。单个细胞在凝胶中的分布是随机的，很多疾病状态很难被忠实的表达出来。微球打印技术可以在3D空间内精准的按照需求排列细胞。
2019 年断层体积式生物打印(Tomographic volumetric bio-printing)的新方法被发表出来(图7 a - b)。当生物墨水被并被特定光源选择性地照射时就会发生聚合并构成最终结构。使用立体打印制造生物材料可以大大的提高生物材料的适配性，并且可以完全避免使用支撑材料和临时材料。用户可以把主要精力放在生物适配性，活性以及功能等研究，无需考虑机械，物理以及结构设计。此外，断层打印的精度更高，打印时间更短，只需要层积式打印机的1/10-1/100。这是一个可以快速生成定制化生物材料的重要突破。在下图中可以看到使用断层体积式打印机打印肝部类器官，微丝微管网络，以及其他精细结构的应用。
图7 a
图7 b
粗略来说，传统挤压式以及激光辅助固化打印技术在打印多种材料，多种细胞，多种密度的生物组织结构上有优势，而新的断层扫描体积式生物打印在精度、分辨率以及保持细胞活性上有优势。
图8
生 物 学 应 用
组织发育和修复
比如生化梯度相关研究(图9)。生化梯度可以为发育组织中的细胞分化提供时间和空间线索。而直接在活体组织中观察发育关联十分复杂， 因为瞬时可能出现指导分化和形态产生的多个信号中心。但是生物打印可以创造出不同生化物质的空间分布使其渗透水凝胶并于细胞相互作用。比如下面关于血管生成发芽的研究(Song et al., 2018)，研究者使用3D生物打印技术创造出微通道，其中左通道播种内皮细胞，右通道灌注细胞生成因子，观察3天内血管通道向右侧生成发芽的分布。他们发现在血管弯曲部位生成发芽的密度增加。
图9
其他研究还包括组织屈曲(Morley et al., 2019)，胶质母细胞瘤模型(Heinrich et al., 2019)，肾近端小管模型(Lin et al., 2019)等。
生物物理形态
在组织生长和扩张的发育过程中，会产生内部压力和表面张力，这可能导致机械不稳定性，例如折叠和屈曲。这些形状变化通过机械传导细胞规格以及细胞外基质(ECM)的重塑影响组织图案化。使用传统体外培养方法重建组织形态发生的生物物理模型非常具有挑战性，但是包含细胞的生物墨水可以在空间上精确控制细胞产生的力以及细胞外基质结构。下面的研究(Morley et al., 2019) 通过改变细丝长度， 直径， 生物墨水和悬浮液的机械性质，观察到一系列机械形变，包括屈曲，轴向收缩，静态稳定等。这个研究模型在跨细胞类型的3D生物物理形态发生方面具有巨大潜力，并且生物打印技术提供了高度的设计灵活性(如图10)。
图10
旁分泌信号
在组织发育过程中，细胞通过几种高度保守的受体和途径使用旁分泌信号进行交流。生物打印技术为体外研究旁分泌信号提供了一个有前景的平台，因为多个细胞群可以通过仿生图案划分在3D矩阵中，而这对于使用传统的细胞培养方法可能具有挑战性。有研究(Kang et al., 2018)使用3D生物打印技术成功打印了脊柱，肝小叶，血管等不同的组织结构， 结果显示相比于传统无空间结构的培养方法，3D打印的组织结构更加成熟(如图11)。
图11
癌症疾病模型
在体外重建癌症环境的复杂性——包括基质和免疫相互作用、血管生成和 ECM 重塑——对于传统培养方法具有挑战性。特别是，众所周知，癌细胞对化疗药物的耐药性受到与周围基质和免疫细胞相互作用的调节，而简化的 2D 细胞培养无法捕捉到这种复杂性(Pauli et al., 2017)。为了开发胶质母细胞瘤微环境模型，使用脱细胞 ECM 墨水的挤压生物打印来创建胶质母细胞瘤细胞和内皮细胞的分隔区域，与混合共培养物相比，它更好地模拟了肿瘤-基质相互作用，并再现了临床观察到的患者特异性对治疗的抵抗力(Yi et al., 2019)。在另一项研究中，使用明胶甲基丙烯酰胺 (GelMA) 生物墨水(Heinrich et al., 2019)打印开发了具有分隔区域的胶质母细胞瘤细胞和巨噬细胞的迷你脑模型。观察到胶质母细胞瘤细胞主动将巨噬细胞募集到肿瘤区域并将它们极化成胶质母细胞瘤-巨噬细胞表型，这证明了与临床生成的转录组数据的相关性。未来的研究可能会以这些技术为基础，整合额外的血管、免疫和基质成分，以提供预测性组织模型来剖析癌症微环境的多因素复杂性(如图12)。
图12
生物打印在探索生物问题方面具有巨大潜力，在这些问题中，传统技术不足以构建所需的复杂性和组织，并且该技术在生物研究中的应用还处于起步阶段。下面还有其他一些生物打印会很有前景的应用，比如研究远距离生化信号的传输，以及以下应用：
不同特性以及最终命运的细胞群界面结构研究。 包括原肠胚形成过程中三个胚层(内胚层、中胚层、外胚层)的诱导和空间分离，以及不同的早期胚胎结构如神经管和体节(早期身体节段)的自组织，区分细胞极性，集体细胞决策等课题。平面细胞极性似乎在驱动上皮小管伸长和塑造颅面软骨方面具有重要作用(Kaucka et al., 2017)。生物打印在此类研究发挥着独特的作用，因为将细胞放置在3D合成界面将开始创建生化到形态图，可用于研究组织界面的发展，如神经嵴。3D生物打印可用于连接支持性ECM水凝胶中的两条细丝，并且可以改变几个参数，例如细胞类型(上皮、间充质)、ECM类型(富含胶原蛋白/层粘连蛋白)、细丝ECM力学(刚度、粘弹性)，和初始灯丝几何形状(直的、弯曲的)。这种方法可用于研究集体细胞行为的局部差异如何产生驱动界面形态变化的内部张力和力，包括局部弯曲和屈曲。
生物/组织/类器官形态变化研究。生物打印可用于创建具有细胞密度梯度的组织，以确定单独的细胞密度是否足以触发尖端-茎表型的形成，如果不能，则需要指定哪些额外的微环境特征。生长因子浓度梯度可以刺激流体样和固体样结构域的形成，以指导生物打印组织的动态重塑，并研究驱动组织流动性的微环境条件(即细胞-细胞相互作用、细胞-ECM 相互作用和形态发生素之间的相互作用)，比如下图所示斑马鱼胚胎的头对尾伸长过程中的形态塑造(Mongera et al., 2018)，他们将为新的类胚胎类器官中的形状变化现象提供定量理解(如图13)。
图13
过去十年生物打印技术已经有了很大的进步，但是每种方式都还有自己的局限性，包括生物墨水的扩展性，打印流程，打印精度等。不过3D生物打印技术还在持续进步， 并且每种方法的进步都在弥补其他方法的不足。将来很可能会在单一平台中包含并利用多种模式，以制造可扩展的，结构稳定的组织结构。
生物打印技术不是独立的技术，在未来，大规模生产组织，类器官应用于同种异体治疗需要能够流水线作业的细胞增殖系统；对于可定制的个性化自体治疗，质量控制和生产策略是必不可少的；创新的生物材料和人工智能算法也可以解决目前在组织工程和类器官制造上的许多问题。
- Liu et al., Filamented Light (FLight) Biofabrication of Highly Aligned Tissue-Engineered Constructs, Advances Materials 2022
- Veiga et al., Current Trends on Protein Driven Bioinks for 3D Printing. Pharmaceutics 2021
- Messaoudi et al., Stem Cells and Extrusion 3D Printing for Hyaline Cartilage Engineering. Cells. 2020
- Bernal et al., Volumetric Bioprinting of Organoids and Optically Tuned Hydrogels to Build Liver-Like Metabolic Biofactories, Advanced Materials. 2022
- Kang et al., A 3D bioprinting system to produce human-scale tissue constructs with structural integrity, Nature 2016
- Mota et al., Bioprinting: From Tissue and Organ Development to in Vitro Models, Chemical Reviews, 2020
