一、线粒体膜电位（MMP）介绍
线粒体是动植物细胞生成ATP的主要地点，是促进细胞能量转换、参与细胞凋亡的重要细胞器。线粒体在呼吸氧化过程中，将所产生的能量以电化学势能储存于线粒体内膜，在内膜两侧造成质子及其他离子浓度的不对称分布而形成线粒体膜电位(Mitochondrial membrane potential，MMP，ΔΨm)。正常的MMP是维持线粒体进行氧化磷酸化、产生三磷酸腺苷的先决条件，MMP的稳定有利于维持细胞的正常生理功能。
图1 线粒体膜电位（Zorova et al., 2017）。
二、为什么要测线粒体膜电位（MMP）？
线粒体是细胞能量和新陈代谢的重要调节者，对维持细胞的生长和存活起着至关重要的作用。线粒体的核心功能是通过氧化磷酸化合成ATP，这就是众所周知的线粒体生物能量学。而ATP的产生，是与线粒体膜电位有关的。线粒体通过由电子传递链产生的膜电位梯度来维持氧化磷酸化，从而驱动ATP的合成。这一步是通过位于线粒体内膜的质子泵完成的，质子泵可以将基质内质子（H+）泵入膜间隙，质子的跨膜转运使线粒体膜间隙积累大量质子，形成跨线粒体内膜的跨膜电位，即线粒体膜电位。当质子返回时便推动生命体最重要的能量货币ATP的产生，人体的ATP有95%为线粒体所提供。
正常情况下，线粒体内膜电位较高，保持在负电位，而外膜电位较低，保持在正电位。当某些因素导致线粒体呼吸链电子传递过程障碍，影响基质内质子（H+）跨膜梯度的形成，就会导致外正、内负的线粒体膜电位下降，即去极化。大量研究表明，线粒体膜电位下降与自噬、凋亡或坏死等有关。线粒体膜电位功能障碍，甚至细微的异常变化，都可能极大地影响细胞内的生物活性，引起各种疾病（阿尔茨海默病、糖尿病和癌症等）。
因此，线粒体膜电位是评价线粒体正常功能的重要指标之一，不仅反映了线粒体功能的完整性，对TP的合成、离子的转运、细胞凋亡的调控以及抗氧化作用都具有重要的影响，同时也反映了细胞的健康状况，对细胞的生存和发展具有重要的意义。另外，检测线粒体膜电位的变化对生物学研究和医学诊断也具有重要意义。所以，我们应该重视线粒体膜电位的变化，并采取相应的措施来保护线粒体的正常功能。
三、线粒体膜电位（MMP）的检测方法
目前评估线粒体功能时，常使用线粒体膜电位荧光探针，这些探针包括JC-1、Rh123、TMRM、TMRE、和DiOC6等，一般属于亲脂性阳离子化合物，在线粒体膜基质空间中积累，与ΔΨm呈反比。其中，JC-1是一种广泛用于检测线粒体膜电位的理想荧光探针，可以检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位以及评估早期的细胞凋亡情况。
四、JC-1检测原理
JC-1染料以电势依赖性的方式积聚在线粒体内，具有多色荧光发射光谱，并允许对线粒体去极化进行比例式半定量评估。正常线粒体内，JC-1聚集在线粒体基质中形成聚合物，聚合物发出强烈的红色荧光；在化合物诱导线粒体膜电位崩溃时，由于膜电位的下降或丧失，JC-1只能以单体的形式存在于胞浆中，发出绿色荧光。这意味着，在健康细胞中，可以出现少量绿色荧光，大多数为红色荧光；线粒体去极化的细胞大多仅显示绿色荧光。因此可以通过荧光颜色的变化反映出线粒体膜电位的变化或者通过红/绿荧光强度的比例来衡量线粒体去极化的程度。
JC-1单体的激发波长为488或514nm，发出绿色荧光，波长为529nm左右；JC-1聚合物的最大激发波长为585nm，发出红色荧光，波长为590nm左右。JC-1可以用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、荧光分光光度计或流式细胞仪检测。
图2 JC-1进入线粒体和聚集物生成的示意图（Sivandzade et al., 2019）。
五、实验流程
CCCP是一种可逆的质子梯度解偶联剂，可快速降低穿过线粒体内膜的电化学电位，导致细胞内线粒体快速去极化，因此CCCP处理的细胞可用做JC-1检测的阳性对照。经CCCP处理后，线粒体膜电位会完全丧失，JC-1染色后观察呈绿色荧光，而正常的细胞经JC-1染色后应显示红色荧光。
1.细胞染色
1.1悬浮细胞
（1）细胞铺板：以6孔板为例，每孔用1mL培养基重悬100万细胞，其他培养器皿以此类推，也可根据自己的细胞类型选择合适的密度进行铺板。
（2）设置阳性对照：取适量CCCP处理细胞，细胞培养箱37℃孵育5min。
（3）JC-1染色：加入适量JC-1，细胞培养箱37℃孵育15min。一般情况，15min足以进行充分的染色。
（4）离心：37℃孵育结束后，400g 4℃离心3~4min，弃上清，注意尽量不要吸除细胞沉淀。
（5）洗涤：用1×PBS洗涤2次，400g 4℃离心3~4min。
（6）结果检测：再用500μL的PBS重悬细胞，用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察，也可以用荧光分光光度计或流式细胞仪分析（绿色荧光：Ex/Em=510/527nm；红色荧光：Ex/Em=585/590nm）。
1.2贴壁细胞
若用荧光分光光度计或流式细胞仪检测贴壁细胞，可先对贴壁细胞进行消化、收集，重悬后参考悬浮细胞的检测方法。若用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜检测：直接参考悬浮细胞实验步骤方法即可。
六、注意事项
（1）CCCP为线粒体电子传递链抑制剂，对人体有害，实验过程中一定要穿实验服并戴一次性手套操作，注意小心防护。
（2）JC-1是光敏感性的，所有染色步骤的操作过程中避免强光接触；未用完的储存液，避光保存，并避免反复冻融。
（3）JC-1染色完成后，应立即进行后续的结果分析，以减少各种可能的误差。
参考文献
Sivandzade F, Bhalerao A, Cucullo L. Analysis of the Mitochondrial Membrane Potential Using the Cationic JC-1 Dye as a Sensitive Fluorescent Probe. Bio Protoc. 2019 Jan 5;9(1):e3128.
Zorova LD, Popkov VA, Plotnikov EY, et al. Mitochondrial membrane potential. Anal Biochem. 2017 Jul 1;552:50-59.
