我们知道，根据阿贝衍射定律，传统荧光显微镜中的光学分辨率限制在200 nm左右。包括Stefan Hell在内的三位科学家凭借在超分辨率光学显微镜领域的巨大贡献获得了2014年诺贝尔化学奖。关于Stefan Hell 提出的STED显微镜的基本原理，之前我们的公众号中已经有多篇详尽介绍，这里就不再赘述。本文重点放在长Stokes位移染料及多色荧光超高应用。作为超高分辨率显微镜的主要技术路线之一，STED显微镜可提供超越衍射极限的光学分辨率（20-40nm)。STED显微镜为了获得更高分辨率，通常采用较强的STED损耗光，这不可避免地会导致荧光基团的光漂白，因此只有光稳定染料适用于最高分辨率的STED显微镜（<30 nm）。而在生物相关的STED 实验中，大多数情况下使用了亮度高、耐光照的短Stokes位移染料。此外，为了提高灵敏度和减少成像时间，也需要荧光量子产率高的荧光基团用于STED超高成像，如Abberior公司的STAR RED 或STAR ORANGE 染料。随着超高显微镜的快速发展，多色荧光超高成像的应用需求越来越多，拥有长Stokes位移的有机荧光染料就成为不可缺少的实验条件。最近几年国内外的一些染料研发团队和商品化荧光成像探针公司，研发具有长Stokes位移（激发峰和发射峰具有更宽的间距）的荧光染料用于超高分辨率多色荧光成像成为一种新的趋势。我们知道，STED多色成像的最终结果主要取决于超高分辨率显微镜的性能、染料的组合、染料与生物大分子生物偶联方法和效率等因素。荧光显微观察（包括共聚焦，超高分辨成像）的主要优点之一就是能够使用几种荧光标记来靶向不同的目标蛋白或分子，并产生多色图像，这有助于识别生物物体的许多结构特征和它们之间的空间位置关系，进而对相互作用研究起到指示作用。对于多色成像实验，需要将不同标签的光谱分离成两个或两个以上的激发或检测通道。在这方面，具有长Stokes位移的荧光基团特别有价值，因为它们允许减少检测通道的数量，避免了不同荧光间的串扰，并简化了多色实验的成像方案（图1）。例如，如果我们将荧光染料与短（10−30nm）和长（>80nm）的Stokes位移结合起来，就可以很容易地实现双色或更多色的STED成像。如果这些染料的发射光谱重叠，则可以使用两种不同波长的激发光来区分它们（见图1）。同时，由于有相似的发射光谱，两种染料只需要一个STED损耗光束，两种染料的精确定位关系也只由这一只STED损耗光决定，巧妙地避免了波长不同造成的显微镜像差。强大的STED光容易引起短Stokes位移染料的再激发（即会在尖锐的超分辨率图像周围产生一个漫射晕）。在这方面，使用长Stokes位移的染料可有效避免这种情况发生。
图1 长Stokes位移染料（绿色）和短Stokes位移染料（红色）的吸收光谱（连续线）和发射光谱（虚线）；这两种染料都可以用一个波长STED损耗光进行耗损。
目前商品化STED使用最多的STED波长为775nm。775nm近红外激光是非侵入性的，具有更大的生物组织穿透度，散射小，并且不会引起蛋白质和生物组织的自发荧光。事实上，大多数荧光染料，特别是具有长Stokes位移的染料都具有广泛的吸收和发射带。这些特性决定了使用固定的775nm波长 STED是该技术的最优选项，提高成像分辨率主要是通过优化775nm的STED功率、脉冲以及门控控制等。通过发射和吸收波段的红移可以扩大利用两种或多种染料进行双色和多色STED成像（图2）。激发“可操纵”荧光染料的波长包括488nm（用于具有长Stokes位移的染料），绿色561nm激光器，以及红色640nm激光器。而目前广泛使用的商品化的长Stokes位移染料有DyLight 515-LS和Abberior 460L（图2）和Abberior LIVE 460L。
图2 Actin(Star-Red)/Tom20(Star-Orange)/ATP5a(Star-460L)，图像来源Dr. Hao Huiwen, Standard Imaging
所有的荧光标记都必须与目标物特异性结合——蛋白质（多肽）、碳水化合物、脂类、核酸、（修饰的）寡核苷酸、毒素、作为“识别单元”的各种“小”分子等等。标记不同的目标物需要具有不同活性基团的荧光染料，这些活性基团专门与目标物相互作用，并有效地将荧光标记附着在所需的目标物上。经典和最稳健的标记方法是间接免疫荧光。最初研发的使用具有较大Stokes位移的荧光染料获得的超分辨率成像结果都涉及到间接免疫荧光（即染料通过一抗和二抗进行链接）。但将免疫荧光与活细胞成像结合起来非常重要，后来研发的用于活细胞的长Stokes位移染料（如Abberior的460L live)就改变了之前只能用于固定标本的局面。并且近年来，随着几种新的蛋白质位点特异性标记方案（如SNAP-tag，Halo-、CLIP-）和点击化学技术的应用，将具有大Stokes位移的染料（如香豆素类）与其结合，实现活细胞和其它更多场景应用，也成为相关领域专家重点研究的方向。2014年诺奖得主，STED发明人Stefan Hell团队在今年新发表的文章(参考文献3）中介绍了他们最新研发的可光活化长Stokes位移荧光染料3a-CF。这种染料基于1-乙烯基-10-硅酮亚胺核心结构，荧光发射扩展至红波段以及具有约100 nm距离的长Stokes位移光活化活细胞渗透染料。可被单光子和双光子激活，适用于固定细胞和活细胞的多色荧光显微成像，并可用于STED（受激发射损耗）和PALM（光激活定位显微镜）超分辨率技术（尽管这两种成像方法对荧光标签有不同的要求）。利用光激活标签进行四嗪连接或自标记蛋白标签(Halo-Tag, SNAP-tag)，可与其它长Stokes位移染料成功进行双色成像（图3）。所以这种光活化长Stokes位移染料在标记生物分子的多色单分子跟踪中未来会有更多的应用。
图3. 光活化长Stokes移位染料双色成像。(a−c) 使用DyLight 515-LS NHS酯间接免疫荧光标记微管和最新研发光活化染料3-NHS 标记线粒体，在 DyLight 515-LS光漂白之前(a)和之后(b)以及(c)405 nm激光光激活3-NHS后的固定COS-7细胞的共聚焦成像。(d)通过(a-c)所示的顺序成像获得的显示微管(品红)和线粒体(黄色)的双色图像。(e,f)放大后线粒体的共聚焦(e)和STED(f)图像。(g)DyLight 515-LS(洋红色)和3-NHS(黄色)的吸收和发射光谱，激发激光 (485nm，虚线)，检测波段(560~700 nm，灰色)；STED波长为775 nm。比例尺：10μm (a−d)，2 μm (e−f)。
简单总结一下，就是：长Stokes位移的荧光染料在多色荧光成像（宽场和共聚焦）尤其在多色超高分辨率成像中的使用价值体现在它的几个优势：首先它扩展了多色荧光成像的选择。其次现有常用长Stokes染料可以将检测光谱位移至细胞自发荧光 (<580 nm )的范围之外，发射红色和近红外(NIR)光谱的荧光基团由于波长较长，降低了光毒性，并且增加了对样品穿透深度。最后，对于最低能量的电子跃迁，具有非常长的Stokes位移荧光基团的激发光谱和发射光谱最大值之间通常有≥80 nm的差异，其吸收光谱和发射光谱之间没有重叠，因此不会因重吸收而自淬灭。近年来，科学家越来越多地利用新的高效染料设计工具、“模块化”方法和灵活的合成方式，相信很快将有更多光稳定和明亮的长Stokes位移染料问世。1. Fluorescent dyes with large Stokes shifts for super-resolution optical microscopy of biological objects: a review. Maksim V Sednev, Vladimir N Belov and Stefan W Hell. 2015 Methods Appl. Fluoresc. 3 042004.
2. Fluorescent Probes for STED Optical Nanoscopy. Sejoo Jeong, Jerker Widengren and Jong-Chan Lee. Nanomaterials 2022, 12, 21.
3. Photoactivatable Large Stokes Shift Fluorophores for Multicolor Nanoscopy. Ilya Likhotkin, Richard Lincoln, Mariano L. Bossi, Alexey N. Butkevich and Stefan W. Hell. J. Am. Chem. Soc. 2023, 145, 1530−1534.
