一、临床实验室生物安全防护措施

（一）生物安全实验室级别（bio-safety level，BSL）

根据对所操作生物因子采取的防护措施，将生物安全实验室分为一、二、三和四级，以BSL-1、BSL-2、BSL-3、BSL-4表示^［3］。BSL-1、BSL-2级实验室应该及时向当地卫生管理部门申请备案；BSL-3、BSL-4级实验室实行强制认可。BSL-2实验室又分普通型和加强型，其中加强型医学生物安全二级实验室指在普通型医学BSL-2实验室中设置缓冲间、机械通风和空调净化系统、排风高效过滤等安全防护措施，且有明确负压或压力梯度要求的实验室，见表1^［4］。

临床实验室适用于二级（涵盖一级）生物安全防护水平的病原体检验，不适用三级生物安全防护水平的病原体检验，且无论是BSL-1还是BSL-2实验室，均应参照二级生物安全实验室实现分区及分流^［5］。临床实验室由防护区和辅助工作区组成。实验室防护区内生物风险相对较大，需对实验室的平面设计、围护结构的密闭性、气流，以及人员进出、个体防护等进行控制，其中核心工作间对临床实验室来说通常是指生物安全柜所在的房间；实验室辅助工作区是指生物风险相对较小的区域，也指生物安全实验室中防护区以外的区域^［1，6］。

（二）生物安全柜

生物安全柜是指具备气流控制及高效空气过滤装置的操作柜，可有效降低实验过程中产生的气溶胶对操作者和环境的危害，以及对操作对象如样本的污染。生物安全柜分为3级，临床实验室通常使用Ⅱ级生物安全柜^［7］，其分类见表2。

生物因子分4个风险等级，Ⅰ级风险因子是指不会使健康工作者或动物致病的微生物和寄生虫等；Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级的风险因子亦可称为“病原体”或“感染因子”，能引起人类和动物发病^［8］。如果仅接触Ⅰ、Ⅱ级风险的样本，生物安全柜内的空气在排放前通过HEPA高效过滤器过滤可以再循环，如生物安全柜-ⅡA和生物安全柜-ⅡB1；如果实验室工作涉及Ⅲ级或以上风险等级的微生物培养物，则禁止将空气再循环，必须使用生物安全柜-ⅡB2或以上级别。

（三）个体生物安全防护装备（personal protective equipment，PPE）

PPE是人们在实验室活动过程中为防御各种有害因子而穿戴和配备的各种用品的总称。PPE选择的基本原则是基于潜在风险种类和程度，可根据是否有效利用安全隔离装置（如生物安全柜）来提高或适当降低PPE的级别^［9］。

1.基本防护装备：必须佩戴口罩、工作服、手套。无论任何材质、标准都可以。

2.一级个体生物安全防护装备：医用外科口罩、乳胶手套、工作服，加手卫生，可戴医用防护帽。

3.二级个体生物安全防护装备：医用防护口罩或N95口罩、乳胶手套、工作服外（一次性）隔离衣、医用防护帽，加手卫生。酌情（比如有喷溅风险）可加护目镜。

4.三级个体生物安全防护装备：医用防护口罩或N95、单或双层乳胶手套（条件许可，可以不同颜色）、面屏、护目镜、工作服外防护服、单或双层医用防护帽，加手卫生。必要时双层口罩（外医用外科口罩，内N95）。

5.特殊生物安全防护装备：例如患者剧烈咳嗽且没有呼吸道屏障时，在三级防护的基础上，可以双层防护服、双层口罩（外医用外科口罩，内N95）、全面型呼吸防护器、三层乳胶手套、双层医用防护帽等。

（四）生物安全实验室良好的工作行为

《实验室生物安全通用要求》（GB19489-2008）^［3］、《WS/T 442—2014 临床实验室生物安全指南》^［6］、《CNAS-CL02-A005 实验室生物安全认可准则》^［10］列举了生物安全实验室标准的良好工作行为和特殊的良好工作行为，应参照执行。

二、临床微生物学检验过程的生物安全风险评估

风险评估旨在为有效的风险应对提供基于证据的信息和分析^［10］。风险评估所依据的数据及拟采取的风险控制措施、安全操作规程等应以国家主管部门和世界卫生组织、国际标准化组织等机构或行业权威机构发布的指南、标准等为依据^［3］。临床微生物学检验过程的生物安全风险评估，是依据《人间传染的病原微生物分类名录》^［11］，根据工作流程及性质，判断潜在危害的严重程度和发生频率。风险评估包括风险识别、风险分析和风险评价3个步骤^［12］，宜参照病原微生物实验活动风险评价表^［1］。

（一）风险识别——临床微生物学检验的操作

不同实验活动所面临的风险不同，临床微生物学检验一般不进行病毒培养，或（细菌、真菌）大量活菌操作（“大量”指微生物的体积或浓度大大超过了常规检测所需要的量。比如在大规模发酵、抗原和疫苗生产、科研活动中，微生物增殖和浓缩所需要处理的剂量），或易产生空气传播的实验操作（如病原菌离心、冻干等）；一般也不进行以活病毒或活菌感染动物的实验；临床微生物学检验的原始样本一般未经灭活。目前可能存在风险的实验室操作如下。

1.病毒：主要是未经培养的感染性材料的操作，泛指未经培养的感染性材料在采用可靠的方法灭活前进行的操作，包括原始样品的离心、涂片、接种、浓缩，以及病毒抗原检测、血清学检测、核酸检测、生化分析等。

2.细菌、放线菌、衣原体、支原体、立克次体、螺旋体、真菌：主要进行样本检测，包括样本的离心、涂片、接种、显微镜观察、病原菌分离纯化、药物敏感性试验、生化鉴定、免疫学实验、PCR核酸提取与扩增等初步检测活动。

（二）风险分析——人间传染的病原微生物

《病原微生物实验室生物安全管理条例》（2018年修订版）^［13］根据病原微生物的传染性、感染后对个体或者群体的危害程度，将病原微生物分为四类，其中第一类、第二类病原微生物统称为高致病性病原微生物。《人间传染的病原微生物名录》^［11］包括160种病毒（其中一类29种、二类51种、三类80种），朊病毒（prion）6种（其中二类5种、三类1种），细菌、放线菌、衣原体、支原体、立克次体、螺旋体共155种（其中二类10种、三类145种），真菌59种（其中二类4种、三类44种）。目录中未列入的病原体和实验活动，由各单位的生物安全委员会负责危害程度评估，确定相应的生物安全防护级别。如涉及高致病性病毒及其相关实验的应经国家病原微生物实验室生物安全专家委员会论证。应基于临床微生物学检验过程中各种感染性材料包括原始样本、培养物、试剂耗材使用等可能存在的人间传染病原微生物分析，进行风险评价。

（三）基于人间传染的病原微生物名录和实验室操作的风险评价

人间传染病原微生物在临床微生物学实验室的传播方式主要是空气传播，防护用品选用应按照分级防护的原则^［14］；其次是接触传播（包括粪口传播，或经过破损的皮肤和/或黏膜伤口侵入）。

很多人间传染的病毒需要BSL-3或以上的实验室，临床实验室一般不具备检测条件，确需检验时要充分灭活，并在加强型BSL-2实验室、生物安全柜-Ⅱ B2中进行，采用二级或三级PPE。

目前已发现的人间传染且临床检验可检测出的细菌、真菌等的样本检测均可在普通或加强型BSL-2实验室中进行。根据传播方式和风险程度不同，需针对性地采取相应生物安全防护措施。

在保证安全的前提下，临床的未知样本检测操作可在生物安全二级或以上防护级别的实验室进行。但此项工作仅限于对样本中病原菌的初步分离鉴定。一旦病原菌初步明确，应按病原微生物的危害类别将其转移至相应生物安全级别的实验室开展工作^［11］。

三、临床微生物学检验过程中的生物安全风险应对

风险应对是在完成风险评估以后，选择并执行一种或多种改变风险的措施，包括改变风险事件发生可能性和/或后果。风险应对是一个递进的循环过程，实施风险应对措施后，应依据风险准则，重新评估新的风险水平是否可以承受，从而确定是否需要进一步采取应对措施^［12］。

基于以上评估结果，制定相应的生物安全操作和防护规范。

（一）基本要求

所有样本、培养物和废物应假设含有与感染性疾病传播相关的活性生物因子，并以安全方式处理^［8］。

实验室的标准操作程序应包括对涉及的任何危险以及如何在风险最小的情况下开展工作的详细指导书。负责工作区活动的管理责任人每年应对这些程序至少评审和更新一次。实验室生物安全负责人有权制止不安全的活动^［8］。

实验室的设施和环境：临床微生物学实验室应严格按照《GB50346-2011生物安全实验室建筑技术规范》中BSL-2实验室的标准进行建设，所有试验操作必须在其防护区进行，基于风险评估结果进一步选择核心工作区或开放区域。各类生物安全标识应规范设置、使用和维护^［15］。

生物安全柜：实验室配备必需的生物安全柜，且其规格、型号、位置等符合操作安全防护的要求。需每年对生物安全柜进行校准，关注其性能（高效过滤器、气流、负压等）是否满足要求^［16］。制定生物安全柜标准操作程序，并对人员进行培训，保证生物安全柜的正确使用和维护。

个人防护装置：至少要达到一级防护（医用外科口罩、乳胶手套、工作服，加手卫生，可戴医用防护帽）。必要时（如操作疑似高风险标本时）应提高个人防护级别，如采用医用防护口罩或N95口罩、工作服外（一次性）隔离衣，酌情（比如有喷溅风险）可加护目镜。

实验室工作人员应遵守生物安全实验室的良好工作行为，建立并执行准入制度，工作地点便于随时查阅生物安全手册^［8］。

为实验室人员提供免疫计划、医学咨询或指导。实验室人员宜定期进行结核、布鲁菌病、病毒血清标志物等相关检测^［17］，基于连续的检测结果评估所采取的生物安全风险应对措施的有效性，新的转阳患者应立即提交到健康管理和感控部门进行流行病学评价。

应有机制记录并报告职业性疾病、伤害、不利事件或事故以及采取的相应措施，同时应尊重个人隐私。

应保持人员培训记录，包括对每一员工的安全指导和安全预备状态的年度更新资料^［16］。

（二）基于工作流程的生物安全防护措施

1.原始样本的留取和运送：所有进行临床微生物学检验的样本均要求使用密闭容器留取，宜采用带旋口的盖子。实验室应制定样本溢洒的处理流程、样本采集送检的标准操作程序，并定期对相关人员进行培训。采集高致病性病原微生物样本的工作人员在采集过程中应当防止病原微生物扩散和感染，并对样本的来源、采集过程和方法等作详细记录^［13］。

2.原始样本的操作：包括涂片、染色、镜检、接种，血液和体液样本的离心、倾倒、加样，组织样本等的研磨、超声洗脱等，由于原始样本中病原微生物未知，需采取以下措施。

原始样本涂片应在Ⅱ级生物安全柜中进行，尤其是对可能存在通过空气传播高风险病原微生物的样本涂片必须在Ⅱ级生物安全柜中进行，必要时提高个人防护装备级别。染色镜检可在BSL-2实验室防护区的开放空间内进行。应在Ⅱ级生物安全柜中进行样本接种，如使用自动接种设备，需严格按照设备说明书进行操作。接种后的培养基需盖盖后取出置培养箱培养，如镜检查见真菌丝，应及时封盖。

抗酸染色：抗酸染色样本涂片应在Ⅱ级生物安全柜中进行，涂片完成后，紫外照射>60 min后染色镜检。染色镜检可在防护区的开放空间内进行。

原始样本及病原菌接种培养：应在Ⅱ级生物安全柜中进行，结核杆菌培养应在加强型BSL-2或BSL-3级实验室进行^［18］。

原始样本其他处理：组织样本研磨、超声洗脱等原则上应在Ⅱ级生物安全柜中进行，或在密闭容器中处理后在Ⅱ级生物安全柜中开盖；对其他无法提供必要屏障的操作如样本离心、消化等，要在Ⅱ级生物安全柜中开盖、倾倒，不得使用自动开盖离心机^［19］。

血培养阳性样本：如疑似布鲁菌（如报警时间3 d左右甚至更长，生长曲线低平等）等可能通过空气和/或接触传播的高风险病原体（二类），应戴医用防护口罩或N95口罩和双层乳胶手套，且必须在生物安全柜内小心谨慎操作，并尽量减少操作，在可疑或已证实的布鲁菌暴露意外事故中，实验室人员应监控血清抗体转换或临床症状^［17］。

3.病原菌鉴定和药敏试验：（1）对已知菌种应根据《人间传染的病原微生物名录》要求进行操作。（2）不能嗅平皿。染色镜检可在BSL-2实验室防护区的开放空间内进行。（3）生化鉴定：鉴定试验如氧化酶等可在防护区的开放空间进行，鉴定系统菌液配制等宜在Ⅱ级生物安全柜中进行。（4）质谱鉴定：靶板点样操作宜在Ⅱ级生物安全柜中进行，使用后的靶板应用75%乙醇等浸泡。（5）菌液配制等操作，包括菌液涂布宜在Ⅱ级生物安全柜中进行；阅板，包括测量抑菌圈直径可在BSL-2实验室开放空间进行（无合适屏障时）。（6）制定菌液或标本溢洒处理流程，准备合适紧急处理用品，并对实验室人员进行相关培训。（7）一旦发现丝状真菌生长，培养皿需及时封盖，其他相关操作应在Ⅱ级生物安全柜中进行。

建议有条件的实验室参照上述执行，如果完全实施存在现实困难，则应基于本实验室风险评估的结果，为以上操作选择合适的生物安全防护措施，包括通过培养良好的生物安全实验室工作行为、适当提高PPE等减少可能发生的生物安全风险。

4. 临床微生物的免疫学检测：血液样本离心如果无法有效利用安全隔离装置，应使用密闭的试管，可以在防护区的开放空间离心，但原则上应在Ⅱ级生物安全柜中开盖，不得使用自动开盖离心机。其他加样、检测等操作经评估确认无明显风险可以在防护区的开放空间进行，但务必做好个人安全防护（至少采用一级PPE）。其他如粪便标本艰难梭菌A/B毒素和谷氨酸脱氢酶检测，可以在BSL-2实验室防护区的开放空间进行。

5.Gene Xpert、Filmarry等快速分子检测：样本加样操作应在Ⅱ级生物安全柜中进行。

6.检测完成后各类样本和培养物的处理：应密封后2~8 ℃保存以备复检或复核，要有明确标识，需规定各类样本和培养物的存放时间。存放到期的各类样本和培养物严格按要求密封后运至洗消间，由专人高压灭菌处理，做好交接记录。未经高压灭菌处理的各类样本和培养物不允许运出实验室^［20］。

（三）生物安全风险应对措施的有效性评价

应定期对生物安全风险应对措施的有效性进行评价，评级标准如下：（1）A级，效果很好，指控制措施符合最佳操作规范，采用明确的标准，并时刻得到遵循。注意：为清除风险，可采用替代方式或工程控制手段。（2）B级，合理，指有控制措施，但未能时刻得到遵循，可能有不符合最佳操作规范之处。注意：管理到位，配备防护性设备。（3）C级，不足，指有部分控制措施，或没有控制措施。未明确采用相应标准。控制措施中没有强调分等级控制的原则。

采取风险控制措施后，须进一步评估残余风险。残余风险可以用矩阵方式来评估，举例见表3。对中或高残余风险，可能需要进一步的控制措施。

应当按照实际工作的性质和状态进行残余风险评估判断，中或高残余风险是否采取控制措施，由实际性质、状态、风险确定。高残余风险一般要采取措施。某种程度上，高残余风险意味着之前的风险控制措施可能无效或效果不够。

执笔人：

公衍文（山东大学第二医院检验医学中心），宁永忠（北京市垂杨柳医院检验科）

专家组成员（以姓氏笔画为序）：

阿祥仁（青海省人民医院检验科），马筱玲（中国科学技术大学附属第一医院检验科），王传新（山东大学第二医院），王辉（北京大学人民医院检验科），公衍文（山东大学第二医院检验医学中心），宁永忠（北京市垂杨柳医院检验科），吕火烊（浙江省人民医院检验科），李敏（上海交通大学附属仁济医院检验科），刘家云（空军军医大学西京医院检验科），刘文恩（中南大学湘雅医院检验科），孙恩华（山东大学齐鲁医院检验科），许建成（吉林大学第一医院检验科），杜鸿（苏州大学附属第二医院检验科），杜鲁涛（山东大学第二医院检验医学中心），杜艳（昆明医科大学第一附属医院检验科），杨志宁（山西省人民医院检验科），府伟灵（陆军军医大学第一附属医院检验科），周宏伟（南方医科大学珠江医院检验科），耿燕（西安交通大学第二附属医院检验科），穆红（天津市第一中心医院检验科），戴媛媛（中国科学技术大学附属第一医院检验科），魏莲花（甘肃省人民医院检验科）