光漂白

本研究的单分子荧光成像结果显示,天然氨基酸麦角硫因可显著提高Cy3、Cy3B、Cy5和Cy5B的光稳定性,相比常用的烷基硫醇β-ME,其荧光光子产量提高了1-2个数量级。与Trolox相比,麦角硫因对所有四种荧光染料的效果也有改善。大量的激光诱导光解实验研究了机制,证明硫代咪唑抗氧化剂麦角硫因是一种生物相容的解决方案,可光稳定最常用的氰基荧光染料,满足荧光成像的要求。

图 1.评估抗氧化剂硫代咪唑氨基酸的光稳定性和信号稳定性 (a) 与荧光团性能相关的光物理和光化学途径。黑色为荧光团光稳定性的理想结果。ISC（红色）是不希望出现的结果，PeT 可将荧光团从激发的三重态中解救出来，在三重态流形中产生一个宝石自由基对，在此 ISC 到单重态流形（希望出现的结果，黑色）与自由基逃逸（需要反氧化剂 ROXS，蓝色）发生竞争。接下来，宝石自由基对进行反向电子转移 gBeT（所需，黑色），再生出基态荧光体，与宝石自由基结合（GRC）途径（与超分辨率中的闪烁有关，棕色）竞争。(b) 本研究中探讨的氰基染料的化学结构。(c) 光稳定剂麦角硫因和 2-硫醇组氨酸的化学结构。(d) 用 143 mM β-ME（顶部，紫红色）和 150 mM 麦角硫因（底部，绿色）对 ssDNA-Cy5B 进行单分子荧光团评估。第一列：4 倍放大的 TIRF 图像（82 μm × 82 μm），记录了数百个附着在生物素化 DNA 上的青色染料分子，比例尺为 5 μm。第二列：相应的光子总数直方图（光稳定性的标志）。第三列：每帧强度（信号稳定性的标志）。第四栏：每秒发射的光子数与存活时间的相关性。(e) 光稳定剂浓度增加时四种荧光团检测到的平均光子数。光子数和误差条是通过各自的直方图和单指数衰减拟合得到的，见参考文献。图中还显示了 β-ME（紫红色）、Trolox（灰色）和不含还原剂的 GODCAT（蓝色）的结果。(f) Cy5 的单分子轨迹：β-ME（143 mM，左图）可观察到闪烁，但 2-硫醇组氨酸（12 mM，中图）或麦角硫因（150 mM，右图）则观察不到。

图 2.通过纳秒 LFP 进行的集合机理研究。(a) 通过单分子分析得出的青色染料的平均光子数与 2-TH 浓度（硫醇形式）的关系。除 Cy3B 外，其他所有染料的线性拟合均以直线表示。(b) Cy3B 受激三重态衰变速率常数（kobs）与 2-TH 硫代硫酸盐浓度的关系。(c) β-ME（‡ 报告于参考文献 (23)）、2-TH、麦角硫因或 Trolox 对四种氰基染料研究得出的 kPeT 值，以及在任一淬灭剂的最大实验浓度下的估计三重态寿命。硫醇基淬灭剂的活性形式（硫酸盐）是通过计算得到的。(d-f）Cy3B 的瞬时吸收（ΔOD）光谱，从左到右依次为无三重猝灭剂、AA [0.19 mM] 和 2-TH [12 mM]。蓝色（430 nm）、绿色（550 nm）和酒红色（630 nm）箭头分别表示氰基吸收、基态漂白和激发的三重态吸收区域。无三重态淬灭剂的 Cy3B 的三重态吸收在 ∼1 毫秒和初始衰减后明显增加（e 面板），这是在本实验中长时间探查监测光束不稳定性的结果。(g) PeT 与氰基染料激发的三重态、自由基逸出（伴随吸收）与二价 ISC 和 BeT（无吸收）的反应方案。(h) AA [1.71 mM] 或麦角硫因 [100 mM] PeT 到 Cy3B 激发三重态时形成的 Cy3B 自由基增长的瞬态吸收时间轨迹。图中还显示了没有淬灭剂时的瞬态吸收带（浅蓝色），说明直接激发时存在残余吸收。(i) 在 AA [11.74 mM]、麦角硫因[100 mM]和无三重淬灭剂（浅蓝色）的情况下，显示了 Cy5B 的相应瞬态吸收时间轨迹。