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实时荧光定量逆转录聚合酶链反应qRT-PCR从理论知识到实践操作
发布时间:2023-10-18 发布者: 浏览次数:

实时荧光定量逆转录聚合酶链反应qRT-PCR从理论知识到实践操作

GBhouse GBhouse 2023-09-24 23:01

1 背景知识介绍

1.1 qRT-PCR原理与应用

实时定量反转录PCR (Real-Time Quantitative Reverse Transcription PCR)PCR技术的一项重大发展,它能够对PCR过程中每个周期产生的产物进行可靠的检测和定量检测。在引入寡核苷酸探针(qPCR引物)后,使得这种技术成为可能,寡核苷酸探针被设计用于在目标序列内杂交。由于Taq聚合酶的5'核酸酶活性,在PCR过程中探针的切割可以用来检测目标特异性产物的扩增

定量逆转录聚合酶链反应(Quantitative reverse transcription polymerase chain reaction),也称为RT-qPCR,用于检测和定量RNA 。在qPCR中,扩增产物的数量在每个PCR反应周期使用荧光值被测量。利用的底物或者模板是cDNA  (complementary DNA, cDNA),而cDNATotal RNA(总RNA)或mRNA首先转录合成。然后将cDNA用作qPCR或实时PCR反应(qPCR)的模板,RT-qPCR用于多种应用,包括基因表达分析、RNAi验证、微阵列验证、病原体检测、基因检测和疾病研究等,是非常常见和通用的一种生物科学实验技术。
对于qRT-PCR称呼有不同的形式,但总体上来说,实时定量反转录聚合酶链式反应(Real-Time Quantitative Reverse Transcription PCR)可能精细一些,毕竟qPCR仪器在采集数据的时候就是一种实时荧光数据收集,当然并不否认定量逆转录聚合酶链反应的称呼是错误的。
1.1 cDNA
cDNA是一种由mRNA逆转录而来的DNA(有单/双链两种情况),通常用于研究基因表达和克隆。cDNA是单链还是双链的根据实际情况,例如RT-PCR, 3'5' RACE,我们只使用单链cDNA(第一链cDNA),其它情况如构建表达载体,qRT-PCR等是双链。一般情况下,cDNA它是在体外经过逆转录后与RNA互补的DNA链(可以参见转录试剂盒的说明书),但是与基因组的DNA复杂序列不一样,因为cNDA来自于mRNA,因此cDNA只有外显子,因为mRNA是通过DNA转录而来,内含子序列或者绝大部分内含子序列已经被丢弃(这原理就是mRNA的剪切作用)。

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(图1 cDNA合成示意图)

1.2 qRT-PCR反应

qRT-PCR反应主要包含四步:首先是双链cDNA结合染料的嵌入;其次是32P探针的标记;接着是用荧光染料标记探针;最后是记录荧光值。

这里主要是运用到Taqman实验技术,该方法利用taqdna聚合酶的5'端内切酶活性,在PCR过程中切割寡核苷酸探针,从而产生可检测信号。探针在其5'端被荧光标记,并且在其3'通过化学修饰不可扩展

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(图2 qRT-PCR检测基本原理图)

1.3 qRT-PCR专业术语(Nomenclature)解读

基线(Baseline):被定义为PCR周期,其中报告荧光信号正在积累,但低于仪器的检测极限。

ΔRn(时间点荧光增量):是每个时间点荧光信号的增量,ΔRn值与循环数关系(S型)。

阈值(Threshold)是根据基线可变性选择的任意荧光水平,检测到高于阈值的信号被认为是实信号,可用于定义样本的阈值周期(Cycle threshold, Ct)。阈值可以对每个实验进行调整,使其在所有图中都处于指数放大区域。

阈值周期(Cycle threshold, Ct)是定义为报告荧光大于阈值的分数PCR循环数。Ct是实时PCR的基本原理,是产生准确和可重复数据的重要组成部分(相对表达量的直接数值,可以认为是最关键数值,平时大家在qRT-PCR中直接关注的数值)。

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(图3 实时荧光定量反转录PCR工作示意图)

2 定量qRT-PCR实操

2.1 qRT-PCR布板

我们以96孔板,6个生物学重复,4个基因,内参以β-Actin为例进行布板:

1 qRT-PCR布板

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2.2 qRT-PCR上样

qRT-PCR加样的体系具体参考试剂公司提供的SYBR qRT-PCR提供的试剂说明书,但是我们一般要准备的是引物(上游引物 &下游引物)以及cDNA模板和ddH2O,在此我们以SYBR mix10 μL体积为例进行加样。

2 SYBR Mix qRT-PCR加样体系

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2.3 qRT-PCR上机

qRT-PCR的扩增程序类似与RT-PCR,主要包含变性-退火-延伸三步,qRT-PCR特殊的一点是在延伸(退火/延伸-两步法糅合在一起)进行了荧光数据的采集,以及多了最后一步的溶解曲线数据采集(仪器默认设置)。

3 qRT-PCR扩增程序

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2.4 数据计算

qRT-PCR的数据计算通用规则是2^-△△Ct计算规则|

即:Ct=Gene Ct – β-Actin Ct

△△Ct=Ct - 参考Ct(一般选择对照组Ct为参考)

下边以一个对照组和一个处理组(Treat),使用Excel进行计算为例

4 qRT-PCR定量数据处理

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表中数据解释:

Gene Ct即基因采集到的循环阈值,有的仪器上显示Cqq前边原理以讲解),β-Actin原理与Gene Ct一样;Ct=gene Ct -β-Actin Ct参考△Ct=NC Ct均值;△△Ct=Ct- 参考△Ct;相对表达量即2^-△△CtExcel输入方法“=power2-△△Ct)”(注意数值就是G列数值取负数)或输入“=2^-△△Ct”,^是输入法在英文状态下同时按住shift+66的上边就有^)即可;

t-test:在这里采用的非配对t检验,Excel输入方法:

选择检验函数:找到excel的函数fxBCC处),然后选择 “TTEST”(图4红框标记)。

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(图4 excelt-test检验的选择方式)

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(图5 选择需要选择检验的两组数据。F3:F8是对照组,F9:F14是处理组,tails=2表示双尾,即不知道显著性的情况下,type=2一般我理解为非配对的t检验模式,当然图中也有注解)

t-test检验数值=

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,即小于0.05,两组数据具有统计学差异。

2.5 图形化数据

这里就不再讲解了,常规作图,1直接使用Excel2使用origin3使用GrapdhPAD


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