1 背景知识介绍
在进行PCR反应时，寡核苷酸引物（Oligonucleotide primers）是必要的。我们需要设计与DNA/ cDNA模板区互补的引物。一次添加一个核苷酸时，必须选择性地阻断（selectively block）和解封（unblock）核苷酸上的反应性基团（reactive groups）。引物的主要特性是它们必须与模板分子上的序列相对应（必须与模板链互补（complementary to template strand））。
当然，引物不需要与模板链完全对应（例如添加酶切位点或者是构建突变位点的引物）；但引物的 3'端必须与模板 DNA 链完全对应（因此我们添加酶切位点均在5'端），这样才能进行延伸。通常在 3' 端使用鸟嘌呤（guanine, G）或胞嘧啶（cytosine, C），尽量不要出现腺嘌呤（adenine, A），引物的 5' 端通常有几个核苷酸的延伸（stretches）。此外，杂交引物（hybridized primers）的 3' 端必须相互指向，因此我们在合成引物的时候均是从5'端到3'端。
引物的长度对于扩增特异性序列很重要。短引物主要用于扩增小而简单的DNA片段。另一方面，长引物用于扩增真核生物基因组DNA样本。然而，引物不应该太长(＞ 30bp引物)或太短（＜15bp），当然我们的模板很纯的时候，引物可以不受这些规矩的限制，可以根据实际情况去定义引物的长度。短引物不准确性更高，换句话说就是非特异性的DNA扩增产物增加，表现在电泳时候出现很多非特异性条带，而长引物的弊端在于导致较慢的杂交速率。平均而言，需要扩增的DNA片段的大小应在1- 10kb以内，实践告诉我们，我们比较号扩增的长度在3Kb及以下，当然也跟物种有关。
（图1 引物扩增示意图。 PCR基因扩增方向和体内合成方向是一致的，即从5'端到3'端。）
引物设计也应该注重以下规则：引物的结构应相对简单，不含内部二级结构，避免内部折叠；我们还需要避免引物-引物退火，它会产生引物二聚体并破坏扩增过程；在设计时，如果不确定在引物的某个位置放置什么核苷酸，可以在该位置包含多个核苷酸，称为混合位点（mixed site）；还可以使用基于核苷酸的分子插入物(肌苷，inosine)来代替常规的核苷酸，以获得更广泛的配对能力。
考虑到上述信息，引物一般应具有以下属性:
（1）长度为18-24个碱基；
（2）G/C含量40-60%；
（3）以1-2对G/C开始和结束；
（4）退火温度(Tm) 50-60℃；
（5）引物对之间的Tm相差应在5°C以内；
（6）引物对不应有互补区域；
（当然这是在比较理想的状态下，如果非理想状态尽量以此作为参考）
2 NCBI引物设计实操
2.1 定量引物规则
最最最重要的是特异性（即只能扩增需要检测的基因），其他规则（1）引物长度为20- 21 bp；（2） 避免引物中连续出现5个或以上相同碱基，例如AAAAA或GGGGG；（3）每条引物两端的碱基最好是G或C（GC碱基之间为三个氢键连接，保证引物与模板连接的稳固性）；（4） GC含量为45%~55%；（5）PCR产物大小为85~300 bp；（6）引物尽可能的跨内含子-外显子；（7）参考上节引物设计规则；（8）其它。
2.2 NCBI设计定量引物
2.2.1 NCBI查看mRNA序列(以人TNF-α)为例
（1）检索人类TNF-α基因，方法如图2-1，点击search
（图2-1 NCBI检索人类TNF-α基因）
（2）NCBI定位到需要进行引物设计的基因，左键点击即可
（图2-2 选择我们需要的研究的TNF-α）
（3）TNF-α的相关信息（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/7124）
因为我们只为设计引物，过多信息不用看，但是，值得注意的是有的基因拥有很多剪切体，因此选择合适的剪接体是非常重要的，如果知道我们具体研究的是哪个剪切体，直接选择即可；如果不知道我们要研究哪一个剪切体，就选择最长的或者研究最多的剪切体。
（图2-3 TNF-α剪切体信息，总共1条收录信息，对其进行qPCR引物设计）
（4）点击：NM_000594.4，转到该mRNA的详细信息页面（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_000594.4）
a. 查看信息包含各外显子、内含子、CDS区域
（图2-4 查看外显子、内含子、CDS区域信息，因为设计的时候尽量跨外显子-内含子）
b. 第一个外显子在1-363，CDS区域在178-897，再借鉴一个设计定量引物规则，一般定量引物会选择mRNA或第一外显子或CDS的前500bp，因此我们这里选择TNF-α前600bp（当然具体多少长度可以适当更改）进行定量引物设计（序列复制或保存为文件均可）。
（5）NCBI引物设计
在这里，我们使用NCBI的BLAST功能选项进行设计
（a）打开NCBI网址（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/），找到BLAST选框，下图红框；
（b）找到“primer- BLAST”选框，并左键单击
（c）新页面首先：输入碱基序列，或者通过文件拖拽序列进入；接着限定上下游引物的起始位置（记住qPCR产物在85-300bp之间的约定，其它的规则软件会自动设定，不用管），在这里我们选择1-150的位置设定为上游（forward primer）-200-500下游（reverse primer）；产物长度设置为85-300，如下图所示。
（d）点击本页面最下边的“get primers”；
（e）核对并提交的序列隶属的基因信息，复选框打钩，点击“submit”即可；
（f）等待界面，软件设计引物需要时间，数分钟甚至更长，等待……即可；
（g）得到引物信息，这里需要查看引物的特异性，及查看引物下边是否还包含其它的mRNA信息，如果不包含表示引物特异性极高，只能扩增到我们需要的mRNA（TNF-α）.
（h）保存所需要的qRT-PCR引物（出现很多条时候，以排名靠前的为主，为了实验尽可能成功，建议合成两对及以上定量引物）
Forward primer: GAAAACAACCCTCAGACGCC
Reverse primer: CGATCACTCCAAAGTGCAGC
3 oligo 7定量引物设计实操
俗话说技多不压身，这个理念对于设计引物也是一个样，极少数情况下NCBI设计的引物在实验中可能不可用，例如溶解曲线不是标准的峰（非单峰）、无法靶向基因，靶向效率低等等。因此，为了实验的成功，在掌握一门其它设计定量引物的办法是极其必要的。对了，文末附上oligo 7的下载位置，不然你们说我耍流氓！
3.1 oligo设计引物规则
具体规则如上所述，回头看看即可，如果还不会把手或者屁股支出来，我打三下，再告诉你这么弄。
3.2 oligo 7设计定量引物
（a）打开oligo 7软件
（b）点击：file-new sequence，然后将序列粘贴进去，并点击红框的 “√”即可；
（c）点击“search- for primers & probs…”，然后选择“TaqMan probs & PCR pairs”/当然选择 “PCR primers”也行，不过出现的数量比较多，最后点击“search”即可；
（d）得到引物信息
e）保存定量引物，务必选择要保存的引物，“file- save- Forward primer”，自己选好位置（找不到不怪我没说清楚）并命名；
上游引物：
下游引物：
（f）合成引物（导出的引物均是5'端到3'端，直接送合成即可）：
Forward primer: CAGACGCTCCCTCAGCAAGGAC
Reverse primer: CCCGGATCATGCTTTCAGTGCTC
（对了打开导出的引物序列需要DNAstar软件，最后在这里也一并送出（windows），下载地址：https://pan.baidu.com/s/1Xd1SGlGo6XxoRTi6NbApLQ；提取码：1179）
