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细胞凋亡检测竟然有这么多种方法?
发布时间:2023-09-29 发布者: 浏览次数:

细胞凋亡检测竟然有这么多种方法?

细胞凋亡是细胞的一种程序性死亡,是生物体中普遍存在的现象。细胞凋亡检测有很多种方法:根据凋亡细胞固有的形态特征,利用光学显微镜、激光扫描共聚焦显微镜和透射电子显微镜等观察细胞形态;根据细胞凋亡过程中不同时期的变化检测是否发生凋亡,常见的有Caspase活性检测、Annexin V检测、线粒体膜电位检测、TUNEL检测等。细胞发生凋亡时,不同时期在不同区域(如细胞膜、细胞浆、线粒体、细胞核等)会发生不同的生理生化改变。因此,针对不同时期的细胞凋亡检测要采用不同的方法。

表1 不同凋亡时期检测方法的选择


我司常用的细胞凋亡检测方法如下:


一、细胞凋亡

关于细胞的死亡,远比我们想象的复杂,它有着各式各样的“花式”死亡方式,细胞凋亡即是其中一种。细胞凋亡,是细胞的一种程序性死亡,是在一定的生理或病理条件下,细胞主动的、高度有序的、自己结束其生命的过程。细胞凋亡是由基因严格控制,为了维持内环境稳定,更好地适应生存环境,期间涉及一系列基因的激活、表达以及调控等,与生物体细胞生长、发育、更新、胚胎形成、个体发育、衰老和损伤细胞的清除等密切相关。


图1 细胞凋亡信号通路(Wu J et al., 2020)

细胞凋亡与细胞坏死具有截然不同的特征,细胞凋亡过程受细胞内一系列相关分子的调控,涉及一系列复杂的生理生化反应,并伴随有典型的形态学改变,最终细胞裂解为若干凋亡小体,并迅速被巨噬细胞或邻近细胞清除,但不会导致炎症反应。


图2 细胞凋亡的过程(Chmurska et al., 2021)

细胞凋亡大致可以分为三个阶段,包括凋亡早期、凋亡中期和凋亡晚期。每个阶段都具有各自的细胞形态学变化和分子特点。

凋亡早期:细胞膜结构发生变化,磷脂酰丝氨酸外翻;通透性改变;起始Caspase激活;线粒体膜电位改变

凋亡中期:效应Caspase被激活,细胞内特定蛋白被Caspase切割

凋亡晚期:DNA断裂;凋亡小体形成;凋亡小体被吞噬细胞吞噬


二、细胞凋亡检测方法
凋亡细胞的许多形态学改变是特征性的,甚至是唯一与凋亡相关的,因此可以作为检测凋亡的基础。凋亡检测的关键是将凋亡细胞与正常细胞以及坏死细胞进行准确的区分。

因此,根据细胞凋亡不同时期的特点,至少有十数种检测细胞凋亡的方法,从大框架上讲,可以划分为基于细胞形态、生物学功能和生化标记三大类。

1. 基于细胞形态学的方法

细胞凋亡的主要形态学特征包括:染色质固缩、DNA片段化、细胞膜起泡、细胞皱缩、凋亡小体的形成等。

1.1 光学显微镜和倒置显微镜

细胞涂片或组织石蜡切片作HE染色、姬姆萨染色或瑞氏染色,在高倍镜下观察凋亡细胞的形态改变,结合显微测量工具可作凋亡细胞计数。

未染色凋亡细胞体积变小、变形,细胞膜完整但出现发泡现象,细胞凋亡晚期可见凋亡小体。贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。染色凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化,核膜裂解、染色质分割成块状,出现凋亡小体等典型的凋亡形态。

本方法简便易行,但在细胞密集的组织中对于改变不典型的细胞判断较困难,常缺乏较为特征的指标,具有较强的主观性,重复性差。本方法可用于凋亡现象的初步观察,作为分析指标之一。

1.2 荧光显微镜和激光扫描共聚焦显微镜

一般以细胞核染色质的形态学改变来评判细胞凋亡的进展情况,常用的DNA特异性染料有:Hoechst、DAPI以及碘化丙啶(PI)。Hoechst是与DNA特异结合的活性染料;DAPI为半通透性,用于常规固定细胞的染色;PI不能透过完整的细胞膜,但在凋亡中晚期的细胞和死细胞,PI能够透过细胞膜而将细胞核染红。因此将Annexin V与PI匹配使用,就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来(Annexin V/PI法)。

1.3 透射电子显微镜

电镜形态学观察是迄今为止判断凋亡最经典、最可靠的方法,被认为是鉴定细胞凋亡的金标准。但此方法只能定性,无法定量(电镜一个视野仅能观察一两个细胞),同时实验过程复杂(固定、切片到拍照),仪器相对昂贵,对检查者的技术水平要求较高,不适合大批标本检测。

在透射电镜下,凋亡细胞体积变小,细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期:细胞核内染色质高度盘绕,出现许多称为气穴现象(cavitations)的空泡结构;Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化;细胞凋亡的晚期,细胞核裂解为碎块,产生凋亡小体。

2. 基于生物学功能的方法

2.1 Annexin V/PI双染色法

磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine,PS)位于正常细胞膜的内侧,但在细胞凋亡早期,PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面,暴露在细胞外环境中。Annexin V是一种Ca2+依赖性磷脂结合蛋白,对PS具有高度亲和力,可与PS特异性结合,因此Annexin V常作为检测细胞早期凋亡的指标。将荧光标记(FITC、PE或EGFP)的Annexin V作为探针,利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。Annexin V经FITC标记后可发绿色荧光。

碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)染色液是一种不能穿透细胞膜的红色荧光染料,可对凋亡晚期细胞及坏死细胞染色。经Annexin V-FITC和PI联合染色后,正常细胞基本无荧光(Annexin V-/PI-),早期凋亡细胞呈绿色荧光(Annexin V+/PI-),晚期凋亡细胞及坏死细胞则呈绿色和红色荧光(Annexin V+/PI+)。Annexin V联合PI法更加省时,结果更为可靠,是目前最为理想的检测细胞凋亡的方法。

2.2 线粒体膜电位检测

凋亡早期细胞,线粒体膜通透性增加,线粒体膜电位(ΔΨm)下降甚至消失。因此,线粒体跨膜电位下降也是凋亡细胞的一个重要特点,被认为是细胞凋亡过程中最早发生的事件(早于核形态的变化和PS的外翻)。一旦线粒体跨膜电位崩溃,细胞就会进入不可逆的凋亡过程。目前常用一些亲脂性阳离子染料如JC-1,通过荧光显微镜观察荧光的强弱来检测线粒体膜电位的变化。

3. 基于生化标记的方法

3.1 凋亡分子Caspase-3活性检测

Caspase(Cysteinyl-aspartic acid proteases)蛋白家族的活化是细胞凋亡的典型特征,在介导细胞凋亡过程中具有非常重要的作用。绝大多数情况下,所有的凋亡信号都会汇集到凋亡的最终执行者Caspase-3上。因此,Caspase-3作为关键的执行分子在细胞凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。Caspase-3在正常细胞中以酶原形式存在,在凋亡早期被活化,但在凋亡晚期及死亡细胞中,Caspase-3活性显著下降。因此可以通过检测Caspase-3剪切体的含量或Caspase-3的活性来反应细胞凋亡过程。此外,也可以通过检测Caspase-3的底物——PARP蛋白的含量来检测细胞凋亡。

3.2 DNA损伤检测

在细胞凋亡的后期,Caspase会激活Caspase-Activated DNase(CAD),切割核小体之间的DNA,形成以180-200 bp为单位的DNA片段,经琼脂糖电泳后,这些大小不同的DNA片段就呈现出梯形条带(DNA ladders)。

3.3 DNA片段原位检测(TUNEL法)

细胞凋亡时,DNA发生断裂,此时暴露出大量的3’-OH粘性末端,可在末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase,TdT)的催化下加上特异荧光探针标记的dUTP,借助荧光显微镜或流式细胞仪进行细胞凋亡的检测。

参考文献

Chmurska A, Matczak K, Marczak A. Two Faces of Autophagy in the Struggle against Cancer. International journal of molecular sciences. 2021 Mar 15;22(6):2981.

Wu J, Ye J, Kong W, et al. Programmed cell death pathways in hearing loss: A review of apoptosis, autophagy and programmed necrosis[J]. Cell Proliferation, 2020.


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