一、腺相关病毒
腺相关病毒（Adeno-Associated Virus，AAV）是一种小型无包膜病毒，属于细小病毒科，1965年从腺病毒分离株的污染物中首次被发现，外部呈现20面体结构，直径约26nm，其衣壳蛋白由VP1、VP2和VP3三种蛋白构成。AAV的基因组是一条单链线性DNA，约4700bp，包括上下游两个开放阅读框（ORF）：Rep和Cap，位于分别由145个核苷酸组成的2个T形反向末端重复序列（ITR）之间。ITR的作用是充当病毒复制起点和包装信号，Rep基因参与病毒复制和整合，编码病毒复制蛋白，Cap基因负责编码病毒三个衣壳蛋白。自然界中存在的天然野生型腺相关病毒，基因组上存在Rep和Cap基因，而实验用的AAV载体，是在野生腺相关病毒的基础上经过人工改造的质粒，基因组上没有Rep和Cap基因，因此也叫重组腺相关病毒（recombinant AAV，rAAV）。在没有特别指出的时候，简称AAV一般指已经改造过的AAV载体。
AVV有许多血清型，目前已从人和猴体内分离出12种AAV血清型，不同AAV血清型具有不同的衣壳蛋白空间结构、序列和组织特异性，因而其识别与结合的细胞表面受体也有很大差别，这也导致不同血清型转染的组织类型、细胞类型和感染效率各不相同，在应用AAV病毒过程中需要根据不同组织器官选择相应血清型的AAV病毒。
由于腺相关病毒具有宿主范围广、安全性高、免疫原性低、表达稳定和物理性质稳定等优点，已被广泛地应用于基础研究和临床试验中，并且腺相关病毒载体已成为世界上最常用的基因治疗载体之一。
图1 AAV基因组结构和病毒粒子示意图（Hudry E et al,. 2019）。
二、腺相关病毒包装
AAV作为一种缺陷型病毒，不能独立复制，需要在辅助病毒（如腺病毒、单纯疱疹病毒）的存在下，才能在感染的宿主细胞中复制合成装配蛋白并生成子代AAV。若缺少辅助病毒，AAV将其基因组整合到19号染色体的一个特别位点（AAVS1）上，整合后保持休眠状态，直到有辅助病毒出现，将其从潜伏状态解救出来。
AV无辅助病毒系统（AAV Helper-Free System）可以在无辅助病毒的条件下生产出重组腺相关病毒。这种系统利用已经明确与调节AAV复制和表达的腺病毒基因产物，并且将这些基因产物通过转染引进宿主细胞。目前采用经典三质粒共转染法大量包装生产rAAV，即外源基因载体质粒、包含辅助Rep和Cap蛋白表达基因的腺病毒辅助质粒和包含Rep和Cap蛋白表达基因的腺相关病毒复制质粒一起转染HEK293细胞一段时间后，收集细胞裂解物超速离心纯化即可得到高滴度病毒。
AAV2作为目前应用最广的AAV，呈现出对骨骼肌、神经元、血管平滑肌细胞和肝细胞的天然趋向性。AAV2具有三种细胞受体：硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（HSPG）、aVβ5整合素和成纤维细胞生长因子受体1（FGFR-1）。HSPG作为主要受体发挥作用，后两个具有共受体活性，使AAV通过受体介导的内吞作用进入细胞，值得注意的是，HSPG在细胞外基质中的丰度可清除AAV颗粒并降低感染效率。
图2 rAAV转导通路（Wang D et al,. 2019）。
三、AAV包装的实验步骤
（1）获取目的基因；
（2）构建AAV载体质粒及测序：将目的基因克隆至AAV载体；
（3）载体质粒、辅助质粒和包装质粒共转染HEK293细胞；
（4）收集AAV粗病毒：离心分别收集细胞上清和细胞沉淀，反复冻融；
（5）AAV病毒浓缩纯化：PEG8000浓缩法/蔗糖密度梯度超速离心法；
（6）AAV质检：包括病毒滴度、质粒残留、宿主DNA残留、BSA残留、支原体检测、衣原体检测、内毒素检测、细菌及真菌检测等。
图3 AAV生产步骤。（Bisgin A et al., 2021）。
四、AAV包装的优缺点
AAV优点：
1、安全性高：迄今从未发现野生型AAV对人体致病，重组AAV是三质粒系统，基因组序列上去除了大部分的野生型AAV基因组元件，只有ITR序列，其他各个基因由独立的质粒表达，进一步保证了安全性；
2、免疫原性低：AAV2的基因组仅4681个核苷酸，便于用常规的重组DNA技术进行操作，而且进行动物实验时造成的免疫反应小，AAV感染组织后很少会被免疫系统清除；
3、宿主范围广：可以感染广泛的哺乳动物并且成功应用于人类和非人类蛋白的表达，不仅可转染分裂细胞，也可转染非分裂细胞；
4、多种血清型：AAV1~AAV9以及DJ、DJ/8、Rh10等12种血清型，不同血清型的AAV可以靶向不同的细胞和组织；
5、表达稳定、持续时间长：不整合到宿主基因组，可长期稳定表达外源基因，在宿主细胞中形成附加体（episome）存在于细胞核中，体内可持续表达6个月以上；
6、扩散性强：与慢病毒和腺病毒相比，AAV可以穿透血脑屏障，是最适合用来感染神经元和胶质细胞的。
AAV缺点：
1、载体容量小：可插入序列比慢病毒要小很多，目前最多只能容纳不超过3kb的外源DNA片段；
2、体外实验表达水平较低：主要是因为rAAV病毒的基因组是单链DNA，在体外环境形成双链并转录翻译外源基因的效率非常低。可以在体外水平感染rAAV病毒的同时感染辅助病毒比如Ad5型腺病毒或者终浓度10~50mM的丁酸钠等方法提高细胞实验的rAAV表达量；
3、表达速度慢：相比较慢病毒和腺病毒而言，rAAV在感染后需要较长的时间来表达外源基因，一般在感染两周后才表达，因为需要从单链DNA变成双链DNA。
五、AAV包装实验中的常见问题
1、为什么很少用AAV做细胞感染，而更适合做动物实验？
因为AAV转染细胞的表达效率低，在没有辅助病毒或辅助因子的情况下，单链DNA变成双链DNA的过程十分缓慢；另外，体外细胞生长速度快，细胞中感染的AAV会随着细胞分裂不断稀释，进一步导致其表达水平降低。但在体内研究中，可以利用不同血清型的AAV，特异性靶向神经系统、眼睛、肌肉和肝脏等多种不同类型的器官组织，且转导途径简便，可以将纯化浓缩好的病毒直接多点注射靶器官，注射的组织细胞通常增殖不会很快，其免疫原性也低于腺病毒，感染效率高于慢病毒，所携带的外源基因表达的因子较为丰富，因此表达丰度和持续的时间更好。
2、AAV的表达效果能维持多久？
AAV在细胞内主要是以环状的dsDNA附加体（Circularised dsDNA episomes）的形式存在，而不会像慢病毒那样整合到宿主细胞的基因组。对于分裂不旺盛的细胞，如神经元，AAV可持续表达1年以上甚至2年，对于分裂较旺盛的细胞，一般也可维持3~6个月或以上。
3、AAV作为一种体内常用的工具载体，可应用于哪些方面？
（1）基因过表达。将目的基因的CDS区构建到AAV载体，注射到动物体内实现过表达；
（2）基因干扰表达。将针对目的基因设计的shRNA构建到AAV载体，注射到动物体内实现干扰表达；
（3）目的基因敲除。将针对目的基因设计的sgRNA和Cas9编码序列分别构建到AAV载体中，注射到动物体内实现基因敲除；
（4）内源过表达。将针对目的基因设计的sgRNA和dCas9分别构建到AAV载体，实现内源过表达。
图4 我司AAV2感染细胞效率实例
参考文献
Bisgin A, Sanlioglu A D, Eksi Y E, et al. Current Update on Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 Vaccine Development with a Special Emphasis on Gene Therapy Viral Vector Design and Construction for Vaccination[J]. Human gene therapy, 2021(11/12):32.
Hudry E, Vandenberghe L H. Therapeutic AAV Gene Transfer to the Nervous System: A Clinical Reality.[J]. Neuron, 2019;101(5):839-862.
Wang D, Tai PWL, Gao G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery.[J]. Nat Rev Drug Discov. 2019;18(5):358-378.
