一、腺病毒和重组腺病毒
腺病毒（Adenovirus，Ad）是一种球形、无包膜病毒，直径约70～90nm，衣壳呈20面体立体对称结构，由252个壳粒组成，其中240个为六邻体（Hexon），另外12个为五邻体（Penton），位于衣壳表面的纤维状刺突是以五邻体蛋白为基底，由衣壳表面伸出的12根纤毛（Fiber），纤毛顶端形成头节区（Knob），五邻体和纤毛的头节区可与细胞表面的受体结合，在病毒感染细胞过程中起着非常重要的作用。Ad的基因组为线性的、非分段的双链DNA（dsDNA），大小约25~45kb，主要包括病毒DNA复制前期的E1a、E1b、E2a、E2b、E3、E4（编码病毒调节蛋白）和DNA复制后期的L1～L5（编码病毒结构蛋白）。Ad的复制不依赖于宿主细胞的分裂，且宿主广泛，可感染分裂和非分裂细胞，具有嗜上皮细胞性，可通过自身纤毛的头节区与细胞表面的特异性受体结合被内吞进入细胞，然后从内吞体（Endosome）转移到细胞质和细胞核内，借助细胞的转录和翻译机器启动病毒的复制组装。
目前已知的腺病毒有52种，分别命名为Ad1~Ad52，其中Ad5是目前常用于改造成复制缺陷的腺病毒载体（Adenoviral Vector，AdV）的一种，其基因组是一个线性的36kb的dsDNA分子。Ad5缺失了腺病毒早期表达的基因序列E1和E3，其中，E1是腺病毒复制所必须的，因此，E1缺失使Ad不能完成自身复制，只能依靠包装细胞提供的反式互补方式进行复制扩增；E3编码的是细胞表面的一种糖蛋白，可对抗宿主的抗病毒防御系统，因此，E3的缺失可减少宿主免疫反应。近年来，腺病毒载体作为一种常用的基因操作工具，已被广泛用于基础研究、疫苗载体及基因治疗研究领域。
图1 腺病毒的结构和基因组（Jt S et al,. 2022）。(A) 腺病毒结构示意图 (B) Ad5基因组示意图
二、腺病毒包装系统
腺病毒包装就是将目的片段克隆到腺病毒表达载体上，表达载体和包装质粒通过重组导入腺病毒包装细胞进行包装。腺病毒包装系统按照重组方式主要分为两种，一种在细菌（BJ5183）中重组，为AdEasyTM腺病毒重组系统，另外一种在QBI-293A细胞中重组，为AdMax腺病毒重组系统，该系统操作简便、重组效率高、获得的病毒产率高、目的基因表达水平高。我司采用的是AdMax腺病毒包装系统，将携带外源基因的腺病毒穿梭质粒（pDC316-mCMV-EGFP）与携带腺病毒大部分基因组的辅助包装质粒（pBHGlox(delta)E1,3Cre）共转染至HEK293细胞，然后利用Cre/loxP重组酶系统产生重组腺病毒。可根据不同的研究需求构建腺病毒穿梭载体，如用于RNAi的腺病毒载体、用于基因过表达的腺病毒载体、用于启动子活性研究的腺病毒载体等。
图2 生成和生产腺病毒载体的四种方法（Singh et al,. 2018）。
三、腺病毒包装的实验步骤
（1）构建腺病毒载体与目的载体；
（2）共转染HEK293细胞；
（3）腺病毒收集：一般在转染后7~10d出现病变（CPE），80%的细胞出现CPE时，收集细胞上清和细胞，进行反复冻融，离心，收集上清后滤膜过滤，-80℃保存；
（4）腺病毒扩增：一般在感染后2~3d出现80~90%CPE，收集细胞，进行反复冻融，离心，收集上清后滤膜过滤，-80℃保存；
（5）腺病毒浓缩和纯化：PEG8000浓缩法；
（6）重组腺病毒鉴定：病毒滴度、质粒残留、宿主DNA残留、BSA残留、支原体检测、衣原体检测、内毒素检测、细菌及真菌检测等。
图3 腺病毒介导的基因传递到哺乳动物细胞。（Lee et al., 2017）。
四、腺病毒包装优势
腺病毒载体作为目前最高效可靠的重组病毒表达系统之一，可用于在哺乳细胞中瞬时且高水平地表达shRNA或目的蛋白。具备以下优点：
（1）宿主范围广：常用于感染难感染的细胞，不仅可感染普通细胞系，也可感染悬浮细胞、原代细胞等，以及感染增殖细胞、非增殖细胞；
（2）感染效率高：病毒滴度可高达1011PFU/mL，能有效进行增殖，适用于基因治疗；
（3）载体容量大：最高可容纳8kb外源DNA；
（4）表达快：感染细胞后，1~2天即可表达，是研究原代细胞及悬浮细胞基因表达的最佳选择；
（5）致病性低，安全性高：AdV携带的基因组不整合到宿主细胞的染色体中，不干扰其他宿主基因。
五、腺病毒的稀释与保存
（1）使用PBS或培养目的细胞所用的无血清培养基；
（2）若短期（7d内）使用病毒液，4℃保存即可；若需长期不用，请置于-80℃保存。反复冻融会降低病毒滴度（每次冻融会使病毒滴度降低10%~50%），因此在病毒使用过程中尽量避免反复冻融。
六、腺病毒包装安全使用和注意事项
（1）进行腺病毒包装相关实验时，穿好实验服，佩戴护目镜、口罩和手套，皮肤不要裸露在外，务必在生物安全柜（BL-2级别）内操作。
（2）若操作时生物安全柜内有病毒污染（病毒液体溅出），立即用70%乙醇加1%的SDS溶液擦拭干净。
（3）腺病毒包装相关实验使用过的枪头、细胞培养皿、EP管和废弃物等用消毒剂消毒、灭菌后（84消毒液和高温灭菌），再进行统一处理。
（4）腺病毒包装相关实验完毕后，仔细清洁双手。
七、腺病毒包装的应用
我司腺病毒载体感染宿主细胞效果良好，可满足众多科研工作者的研究需求。我司采用的重组腺病毒系统含EGFP报告基因，根据实验要求重组包装的腺病毒在感染目的细胞后，可在荧光显微镜下观察其荧光确定细胞感染的程度；或用于动物体内实验时，在动物活体成像仪上观察EGFP荧光强度。同时可进行相关功能表型或分子功能学的研究。但应注意AdV免疫原性高，在某些对外源刺激敏感的动物模型和组织中易造成炎症反应，体内应用需谨慎。
图4 我司腺病毒感染细胞效率实例
参考文献
Lee CS, Bishop ES, Zhang R, et al. Adenovirus-mediated gene delivery: Potential applications for gene and cell-based therapies in the new era of personalized medicine[J]. Genes & Diseases, 2017, 4( 2):43-63.
Jt S, M H, Wam B, et al. Adenoviral vectors for cardiovascular gene therapy applications: a clinical and industry perspective.[J]. J Mol Med (Berl), 2022;100(6):875-901.
Singh S, Kumar R, Agrawal B. Adenoviral Vector-Based Vaccines and Gene Therapies: Current Status and Future Prospects[M]. 2018.
