不同于永生化细胞系，原代细胞直接取自活体组织，能更真实地反映体内环境，因此在生物医学研究中占据重要地位。原代细胞已经被广泛用于分子生物学、细胞生物学和生物医学基础研究，如蛋白质组学、基因组学、细胞研究和遗传研究。它们还是生物制药中使用的理想细胞模型，如疾病机制研究、药物筛选、药物代谢、毒理学研究、癌症药物研究和治疗开发。来自不同物种的原代细胞可用于改变临床前试验中使用的物种之间的潜在差异，以及从动物模型推断人类数据的准确性。在科研工作中，分离和培养原代细胞是基础且关键的一环。然而，由于不同细胞类型和组织来源的多样性，这一过程充满挑战。
目前为止，本人分离过的细胞有：成纤维细胞，肌肉微卫星细胞，脂肪间充干细胞，骨髓间充干细胞，脐带间充干细胞，肝细胞，下丘脑细胞，血管内皮细胞，骨髓巨噬细胞等，在分离过十多种原代细胞后，我总结了一些宝贵的经验，希望能对相关研究者有所帮助。
一、了解细胞和组织的特性
每种原代细胞都有其特定的生物学特性和生长需求。在分离前，了解目标细胞的基本特性是成功的第一步。例如，神经细胞对氧气和营养的需求较高，而肝细胞则对外界刺激比较敏感。这些特性决定了分离和培养时的具体条件，包括酶的选择、消化时间、培养基成分等。在原代细胞的分离过程中，组织块法和酶消化法是两种常用的方法。每种方法都有其独特的优缺点，适用于不同的应用场景。常用到的方法主要包括机械分离、酶消化、贴壁筛选、磁珠分选和密度梯度分离法。
小鼠肺原代细胞分离流程
小鼠肝脏原代细胞分离流程
小鼠皮肤成纤维细胞分离流程
小鼠BMSCs贴壁筛选法分离流程
小鼠BMSCs免疫磁珠分选法分离流程
小鼠小胶质细胞(percoll)密度梯度离心和磁珠分选的流程
组织块法的优点：
1. 操作简便：不需要复杂的仪器和试剂，实验步骤相对简单。
2. 细胞损伤小：避免了酶消化过程中可能对细胞造成的损伤，细胞的结构和功能保持较为完整。
3. 细胞存活率高：由于没有使用酶，细胞的存活率相对较高。
组织块法的缺点：
1. 细胞获取效率低：由于细胞从组织块中迁移出来需要较长时间，获取细胞的效率较低。
2. 污染风险高：组织块在培养过程中易受到细菌和真菌的污染，要求严格的无菌操作。
3. 异质性大：组织块中包含多种细胞类型，难以获得纯化的目标细胞。
组织块法的应用：
组织块法适用于细胞类型较为敏感、对酶消化有较大耐受性的组织，如一些神经细胞和心肌细胞。同时，也常用于体外研究，研究细胞在组织微环境中的行为。
酶消化法的优点：
1. 高效快速：酶消化可以在较短时间内从组织中分离出大量细胞，提高了细胞获取的效率。
2. 细胞纯度高：可以结合细胞分选技术，如流式细胞术，获得高纯度的目标细胞。
3. 可控性强：通过调整酶的种类、浓度和消化时间，可以精确控制细胞分离的效果。
酶消化法的缺点：
1. 细胞损伤风险：酶消化可能对细胞膜和细胞结构造成损伤，影响细胞的功能和活性。
2. 操作复杂：需要较多的试剂和设备，操作步骤较为复杂，需要经验和技巧。
3. 细胞活性下降：长时间或高浓度的酶消化可能导致细胞活性下降，影响后续实验结果。
酶消化法的应用：
酶消化法广泛应用于各种细胞的分离，尤其是那些对酶较为耐受的细胞类型，如成纤维细胞、内皮细胞和上皮细胞。适用于需要大量细胞进行研究的实验，如分子生物学、药物筛选和组织工程等领域。
不同组织消化方案有所不同，同种组织的消化方案也不尽相同，考虑到组织的特殊性及酶的多样性，针对具体组织仍需试验摸索以确定最佳消化方案。以下组织消化方案仅供参考。
正常组织：
肿瘤组织：
在选择细胞分离方法时，应综合考虑细胞类型、实验需求和技术条件。对于细胞耐受性较高、需要大量细胞的实验，酶消化法是较好的选择。对于细胞敏感性高、需要保持细胞完整性和功能的实验，组织块法则更为适用。
总之，组织块法和酶消化法各有优缺点和适用范围，研究者应根据具体实验需求选择最合适的方法，以获得最佳的实验结果。通过不断优化操作流程和技术细节，可以进一步提高细胞分离的效率和质量，为生物医学研究提供可靠的细胞模型。
二、优化分离方法
不同细胞需要不同的分离方法。酶消化法、机械分离法和密度梯度离心法是常用的三种方法。酶消化法适用于大多数组织，但需要精确控制消化时间和酶浓度，以避免细胞损伤。机械分离法适用于较脆弱的细胞，如脂肪细胞。密度梯度离心法则常用于血细胞的分离。不同的组织适用不同细胞分离方法，比如肝脏或肺，都属于有腔室的器官，适合用灌流结合酶消化法；而皮肤等成纤维细胞适合组织块或酶消化法。根据细胞类型（贴壁细胞或悬浮细胞，可传代或不可传代）和研究目的（单细胞测序或细胞培养）选择合适的方法，能显著提高分离效率和细胞存活率。
三、严格控制实验环境
原代细胞对外界环境非常敏感，实验环境的细微变化都可能影响细胞的存活和功能。保持无菌操作是基础，同时应严格控制温度、湿度和二氧化碳浓度。在细胞培养过程中，定期检查培养基的pH值和污染情况，及时更换培养基，保证细胞的健康生长。
四、选择合适的培养基
培养基的选择直接影响原代细胞的生长和功能表达。不同细胞对培养基成分的需求不同，应根据细胞类型选择特定的基础培养基，并添加相应的生长因子、血清和其他补充物。例如，内皮细胞需要添加特定的生长因子，而神经细胞则需要添加B27等补充物。此外，血清的质量和批次差异也会对细胞产生影响，应尽量使用经过验证的高质量血清。
五、优化细胞传代和扩增
原代细胞的传代次数有限，通常在传代过程中容易发生衰老和变异。为了延长细胞的使用寿命，传代时应尽量减少细胞的机械损伤，并保持适宜的传代密度。扩增过程中，及时调整培养条件，确保细胞的最佳生长状态。
六、定期检测细胞质量
为了保证实验结果的可靠性，定期检测细胞的质量非常重要。包括形态学观察、增殖能力测试和功能检测等。例如，通过免疫荧光染色检测细胞标志物，确保所分离的细胞群体纯度和特异性。此外，基因表达分析和蛋白质表达检测也能提供有力的质量控制数据。
七、记录和总结实验数据
在细胞分离和培养过程中，详细记录每一步的操作和观察结果，有助于总结经验和改进方法。实验记录应包括组织来源、细胞类型、分离方法、培养条件、传代次数等信息。通过不断总结和优化，可以提高实验的成功率和重复性。
总之，原代细胞的分离和培养是一个复杂且技术要求高的过程。通过了解细胞特性、优化分离方法、严格控制实验环境、选择合适的培养基、优化传代和扩增过程、定期检测细胞质量，并详细记录实验数据，可以提高分离和培养的成功率，确保实验结果的可靠性。希望这些经验能为从事原代细胞研究的同行们提供一些帮助和启示。
参考文献：
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https://www.bio-equip.com/showarticle453123885.html
https://www.chaselection.com/newsinfo/294.html
Mitra A, Mishra L, Li S. Technologies for deriving primary tumor cells for use in personalized cancer therapy. Trends in biotechnology. 2013 Jun 1;31(6):347-54.
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