我们都知道荧光显微照片可以显示组织中标记分子的位置，对吧？好吧，也许不是。事实上，在荧光模式下，你可以用大多数激光扫描共聚焦显微镜测量的是在特定时间收集的光子数量的一些特征。我们希望这是对一两个有趣参数的精确测量——局部分析物浓度或局部离子浓度。事实上，在任何给定时刻，许多因素都会影响实际存储在计算机存储器中的数值。
图1-共聚焦显微镜三维成像
通用激光扫描共聚焦显微镜的流程图显示了文本中提到的“39”个特征中的许多的位置，如图1所示。所示的系统是基于倒置光学显微镜配置的活细胞成像。以下文本中提到的单个组件在图中用字母(a)到(g)标记。该插图包括三个光学切片，沿着z轴通过抗体标记的果蝇胚胎在不同水平上拍摄，并指定为Z1， Z2和Z3。
多年来，不列颠哥伦比亚大学每年6月举办的“活细胞三维显微镜”课程的学生们编制了一份这些无关因素的清单。第一年，名单增加到39个条目，所以我们借用了阿尔弗雷德·希区柯克电影的名字作为我们的名单。从那以后，名单一直在增长！
尽管本文不能完整地描述每个术语，但还是提供了简短而有用的解释。这些术语以粗体字出现，许多术语与其他粗体字的术语相互作用。请注意，这些变量中的许多通常是根据它们对空间分辨率的影响来考虑的。在这里列出它们是因为降低的分辨率意味着“将相同数量的激发光子放入更大的光斑”。这降低了激发强度——一个给定分子产生的光子数量——以及这些光子中被探测到的部分。人们常常忘记，在荧光共聚焦显微镜中，在最亮的区域，正常的信号水平仅对应于10-20个光子/像素。在这种情况下，统计噪声是比Abbe方程定义的更重要的空间分辨率限制：
在方程中，d（min）表示周期性光栅中可以分辨的最小间距，表示为试样空间中的横向距离；λ（0）是真空中光的波长；NA（obj）和NA（cond）分别是物镜和聚光透镜的数值孔径。该方程确定了物镜和聚光镜数值孔径在确定给定波长光的图像分辨率中的作用。
激光单元（图1（a））是照明源，一般来说，测量的荧光与激光功率水平成正比。虽然激光总输出功率通常是调节的，但多线激光器每条线中的功率量可能不是，并且可能随时间变化很大。波长影响光学性能，并通过染料的吸收光谱决定产生的荧光量。
功率输出不稳定通常是噪声；它的不稳定性通常不到1%，但随着年龄的增长，激光器可能会变得越来越不稳定。由于灰尘、错位或机械不稳定会导致10-30%的随机变化，因此与连接光纤（如果使用）的光耦合效率至关重要。
激光镜的对准和反射特性可能是激光输出长期漂移的来源。由于激光的来源是由激光镜决定的，因此光束指向误差/对准很重要。这里的不稳定性将表现为亮度的变化，因为表观源位置的变化将改变将激光耦合到大多数仪器中使用的单模光纤的光学效率。
物镜的数值孔径（图1（b））会影响可以收集的试样发出的光的比例。激光发出的光也是如此。
物镜放大倍数与物镜入瞳直径成反比。只有当整个入射光瞳充满激发激光时，物镜才能正常工作。填充不足会降低空间分辨率和峰值强度。过量填充会导致一些激光照射到物镜的金属安装上并丢失，也会降低光斑的强度。
清洁度很重要，脏的光学元件会产生更大、更暗的斑点。
透射率（入射到物镜上可以聚焦到物镜另一侧光斑的光的比例）随波长而变化。小心在红外范围内使用一些相对较新的多层光学器件。色差和球面像差都会使光斑变大，并随波长而变化。此外，球面像差随着盖玻片厚度和浸没和嵌入介质的折射率而强烈变化。
衍射是光学分辨率不可避免的极限。它有效地放大了小于衍射极限的物体的图像，使它们看起来比应有的要暗。
扫描系统（图1（c）），特别是变焦放大控制，决定了样本上像素的大小。对于奈奎斯特采样，像素应至少比您期望在样本中看到的最小特征小两倍。假设瑞利准则分辨率为200纳米，像素应小于100纳米。较大的图像会产生欠采样，降低小特征的记录亮度。
漂白率的影响与变焦倍率的平方成正比。至于扫描速度，特定像素上的停留时间越长，检测到的信号就越多，泊松噪声失真的信号就越少。在高扫描速度（小于100纳秒/像素）下，可以减少来自荧光衰减常数长于此停留时间的染料的信号。
光栅大小——与缩放倍率一起，光栅边缘的像素数将决定像素大小。更多的像素（1024 x 1024对512 x 512）会降低欠采样的可能性，但这意味着要么通过减少收集的光子数量和增加泊松噪声来减少在每个像素上花费的时间，要么需要更多的时间来扫描更大的图像，并可能导致更多的白化。光学元件或扫描镜可能会引入几何失真，从而导致物体形状和图像之间的不一致。环境很重要：振动和杂散电磁场可能是由各种设备引起的，例如冷却风扇。这些可能会导致不适当的镜子偏转，从而导致可能随时间变化的失真。
其他光学元件包括透射，它描述了光学元件中没有吸收和反射损失的度量，特别是中性密度或带通滤波器、分束器和物镜。空气/玻璃界面的反射通常表示信号丢失，但可能表现为与试样结构无关的亮点。镜面反射率在红外和紫外波长上可能是一个很强的函数，并且会随着暴露在湿度和灰尘中而降低。
盖玻片厚度是最便宜的光学元件，也是最容易被粗心选择的。其厚度应为170±5微米。对于浸油，其折射率必须与所使用的物镜精确匹配。这可能只发生在很小的温度范围内，或者可以定制混合。焦平面位置很重要，因为略高于或略低于焦平面的特征会比焦平面中的特征看起来更暗。在收集三维数据时，还必须在z平面的间距内进行奈奎斯特采样。最后，载物台的机械漂移会导致实际成像的物体平面随时间变化。
感兴趣的染料的浓度可能是你想要测量的。渗透（或空间排斥）样品通常是离子强度和pH值的函数。吸收截面是染料分子吸收的激发光子通量分数的测量值。它受到与探针结合的方法、pH值、比离子浓度和离子强度的影响。
量子效率描述了从激发光子吸收的能量将作为荧光光子重新辐射的可能性。它是波长的强函数，也受到pH值、特定离子浓度、离子强度和染料-蛋白质相互作用的影响。当使用大于1毫瓦的激光功率和高数值孔径物镜时，会发生单态饱和。然后，光的强度足以使交叉附近的大多数染料分子进入激发态，从而降低了有效的染料量子效率。
装载量是指你放入细胞的染料量。重要变量包括染料分子/抗体或其他蛋白质标记物的数量，以及使用的固定/渗透方案。淬灭是指一个染料分子发出的荧光被附近的其他染料分子吸收。卸载是指细胞中的染料，但现在已被抽出或以其他方式灭活。
底物反应速率适用于具有荧光性质的染料，这些荧光性质与它们与细胞中的离子或其他分子的相互作用有关。像素停留时间在微秒级，因此可能没有足够的时间达到平衡。预漂白是指在进行本次测量之前对染料进行漂白。
区隔化是染料在细胞内的再分配过程。染料相互作用不仅指刚才提到的猝灭，还包括荧光共振能量转移（FRET）。当一种染料的发射光谱与几纳米外的第二种染料分子的吸收光谱重叠时，就会发生这种情况。FRET可以导致仅在第二染料的发射波长处发射光。如果第二个分子没有荧光，就像通常发生的那样，荧光就会消失或熄灭。染料对样本的影响可能会影响许多环境变量，包括样本存活率的恶化。
试样的折射率（图1（d））及其包埋介质将决定球面像差的严重程度。即使使用水物镜观察含水生物标本，匹配也不太可能完美，甚至接近。随着穿透深度的增加，这种球面像差是信号损失的主要原因。
使用具有正确折射率和色散（折射率随波长变化）的浸油至关重要。此外，确保浸没介质中间没有气泡作为透镜。使用用于对齐相位环的Bertrand透镜进行上下聚焦检查。
样本的生命状态会影响实验结果，因为，例如，垂死的细胞与活细胞具有不同的形状、大小和离子环境。自体荧光是指内源性荧光化合物的存在。这些分子的效率可能因pH值、离子浓度和代谢状态而异。不正确的固定可能会产生额外的自发荧光，特别是在使用戊二醛时。
物镜和焦平面之间的折射结构或细胞器，例如球形脂质球，可能会将光束重新聚焦到完全未知的位置。较小的特征可能影响较小，但任何将光散射出光束的折射特征都会降低激发点的强度，从而降低检测信号的强度。它们的累积效应也使细胞的折射率远高于水的折射率。
焦平面上方或下方是否存在高度染色的结构是指有限的z分辨率。如果高度染色，大型结构也可能吸收大量的激发光。
穿过针孔的信号（图1（e））与针孔直径（或其尺寸）的平方成正比，通常设置为等于针孔平面上艾里盘的直径。对准很重要，聚焦在试样上然后通过光学系统重新聚焦的激光图像应与针孔的中心重合。
探测器（图1(f)）通常是一个光电倍增管（PMT）。检测到的信号与量子效率成正比。在大多数共聚焦仪器中使用的光电倍增管的有效量子效率从光谱的蓝端约15%下降到红端约4%。至于反应时间：大多数荧光信号可以迅速放大，但其他的探测器，如跨膜电流，反应缓慢，使得慢扫描速度是必要的。
PMT电压决定了PMT的放大倍数。50伏的增加对应于增益增加约两倍。请注意，PMT黑电平或（亮度）控制允许从呈现给数字化仪的信号中添加或减去任意量。应设置黑色电平，使图像最暗部分的信号电平为5-10个数字单位。
有许多可能的噪声源，所有噪声源都会使记录的值失真。通常，PMT产生的暗电流噪声与信号电平相比很小。然而，对于允许变暖或观察染色不良的标本的红色敏感PMT来说，这种情况就不那么真实了。除了可能无意中到达PMT的杂散光外，剩余的主要噪声源是泊松噪声或统计噪声。这等于在给定像素中记录的光子数的平方根。其结果是，即使信噪比有所改善，它在更高的信号电平上也会变得更大。
数字化，通常使用计算机（图1(g)）应该是线性的。呈现给“8位”显微镜数字化仪的电子信号必须在1到255之间进行记录。由于统计噪声，10到220之间的值更安全。数字转换因子是指检测到的光子数与存储的光子数之间的比率。这取决于PMT电压和其他电子增益，但通常在8位仪器上记录的正常样品约为30。
记住，要准确测量其中一个因素，必须保持其他38个因素不变。
