激光扫描和多光子共聚焦显微镜中的光谱成像
通过应用空间扫描光谱成像技术，可以使用点扫描或线扫描仪器在单次扫描中同时采集样本的整个光谱。这种方法对于活细胞成像和探测厚组织特别有用，在厚组织中，样本通常必须反复扫描，因此暴露在大量潜在的破坏性激发光照下。光谱成像的空间扫描方法需要使用衍射光栅（图8（a）和8（c））或棱镜（图8）。这些仪器的工作原理是通过棱镜或光栅色散将荧光发射分离为其成分波长，然后使用可变宽度狭缝或多通道光电倍增管收集光谱的选定部分。为了控制配备狭缝的共聚焦仪器中的波长选择带宽，孔径大小是可调的。对于包含多通道光电倍增管的仪器，可以改变衍射光栅尺寸（通过将具有不同线间距的新光栅旋转到光学序列中），以控制进入探测器中每个通道的波长数量。这两种仪器设计的共同点是存在多个检测通道，确保捕获的光谱中没有物理间隙。无论带宽大小如何，单个lambda堆栈中可以收集的图像数量仅受光电倍增管或通道数量的限制。
用于光谱成像的最通用的共聚焦显微镜配置可以通过利用多通道光电倍增管在使用衍射光栅分散荧光发射后收集有限尺寸的波长带，大大提高收集λ堆叠的采集速度（见图8（c））。这种采集策略已在尼康C2+和A1共聚焦仪器中成功实施，每台仪器都能够通过单次扫描进行高速光谱采集。这些仪器中的多通道光电倍增管（通常称为多阳极光电倍增管）包含单个10纳米检测通道的线性阵列，这使得多个发射波段能够并行成像，从而严重限制了样品的光漂白和光毒性。尼康光谱检测单元具有多个衍射光栅，采样增量为2.5、5（或6）和10纳米，可以单独旋转到光路中以调整λ部分的光谱带宽。然后将分散的发射传递到32通道多阳极光电倍增管中精确定义的通道，从每个通道生成单独的图像。荧光发射的总带宽由衍射光栅的采样增量决定：2.5纳米采样产生80纳米带宽，5纳米光栅产生160纳米带宽，6纳米光栅产生192纳米带宽，10纳米光栅产生320纳米带宽。在尼康系统中，光谱成像探测器采用激光屏蔽机制，消除了来自激发源的反射激光，并且衍射光栅可以倾斜以选择任何子采样带宽。
图9-尼康A1高级DEES和光电倍增校正
在高性能光谱成像共聚焦显微镜的先进功能中，尼康独特的专有衍射效率增强系统（DEES），旨在消除偏振伪像，减少光栅处的波长损失，并捕获最大数量的荧光发射。该系统的工作原理是将非偏振荧光发射通过偏振双分束光学元件，产生分别平行于入射面和垂直于入射面称为p和s的两个分量波前。用s偏振光观察到的衍射效率最高，因此在p偏振光的路径上放置偏振旋转器产生s偏振光，大大提高了光栅系统的效率。如图9(a)所示，在450 ~ 675纳米的波长范围内，p偏振光的衍射效率在90%以上。相比之下，s偏振光的效率在450纳米处为80%，在675纳米处几乎呈线性下降至约45%。因此，尼康迪斯系统可以显著提高光谱检测单元的光吞吐量，从而提高灵敏度。在必须调整光谱宽度的情况下，可以进行额外的样品扫描，或者将相邻的检测器通道组合（称为合并），使检测带的宽度增加一倍、三倍或四倍。
尽管基于狭缝的光谱成像共聚焦仪器能够以高分辨率成像发射光谱，但与配备多阳极光电倍增管的显微镜相比，它们相对较慢。即使是那些以镜面狭缝为特征，将部分带宽反射到第二或第三个光电倍增管的仪器，在活细胞成像所需的时间尺度上，仍然存在成像速度不足的问题。在许多情况下，在基于狭缝的系统中测量超过200纳米的光谱可能需要几分钟或更长时间，从而阻碍了在整个成像周期内经历时间运动的标本的光谱成像。其中先进的功能，提高光谱成像显微镜的性能是灵敏度校正多阳极为基础的显微镜（见图9(b)）。这些仪器使用发射线和基于可追踪光源的亮度调整来校正每个单独通道的波长精度。此外，光纤元件的末端和探测器表面涂有专有的抗反射剂，以减少信号损失并实现高光传输。最后，在图像处理电路中加入了先进的双集成信号处理（DISP）技术，以提高电气效率，防止在数字化仪处理像素数据和复位时信号丢失。因此，在整个像素停留时间内对信号进行监控，从而大大提高了信噪比。事实上，这些组合技术能够以每秒24帧的速度实现32通道光谱成像（512 x 512像素），足以满足各种活细胞成像应用。
除了使用荧光发射来产生λ堆栈进行光谱成像外，该技术还可以扩展到利用所研究的荧光团的激发光谱特性。基于激发的λ堆栈可以通过改变激发波长并使用单个检测器收集荧光发射来获得。由于发射是在单个通道中收集的，因此信噪比通常很高，并且在数据处理方面具有优势。使用为发射光谱数据设计的相同线性解混算法分析激发λ堆栈（见下文）。激发λ堆栈可以使用单独的激光线和宽带源收集。
在多光子显微镜中，光谱成像是一种强大的分析工具，其激发源通常是连续可调谐的近红外脉冲激光器。利用多光子技术有效分离荧光团的潜在能力得益于这样一个事实，即许多具有高度重叠发射光谱剖面的荧光团具有明显较少重叠的不同多光子激发光谱。在这种情况下，线性解混应该能够分离荧光探针，否则会有太多的发射重叠而无法解决。当检测具有非常相似发射谱的荧光探针时，这一前景尤为重要，例如Alexa Fluor 488，荧光素和SYTOX Green，它们在激发谱中的光谱重叠远小于其发射谱。多光子技术在从蓝色和绿色光谱区域的自身荧光中分离选定荧光团的发射方面也有潜在的用处。
图10-多色共焦成像的多阳极光电倍增管分箱
在激光扫描共聚焦显微镜中实现可变带通检测和光谱识别的最新进展，在微调一般成像的发射检测带宽方面，比传统的干涉滤光片提供了更大的灵活性。在许多情况下，成功的分离荧光发射受到阻碍的事实是，该仪器没有配备最佳的过滤器为所选的荧光团。上面讨论的每种光谱成像配置都提供了自由配置检测波长范围的能力，这使得研究者能够为几乎任何感兴趣的荧光团设计定制的带通设置。例如，使用尼康C2+或A1共聚焦仪器，V-Filtering软件选项能够对多达四个选定通道进行分频，从而从一个或多个所需的发射波长范围生成图像（参见图10）。无论数据最终是否用于线性解混分析，都可以这样做。因此，现代光谱成像共聚焦显微镜在常规成像场景中为消除荧光团光谱重叠提供了显著的优势，并且还提供了为新开发的荧光探针轻松创建定制发射带通配置的能力。
处理光谱图像
从宽视场或激光扫描共聚焦显微镜获得的典型λ堆栈通常包含数十万甚至数百万个单独的光谱（取决于图像尺寸），每个集合中的一个像素。由此产生的数据集非常大，因此过于复杂，无法直观地解释。处理和显示光谱图像数据需要一套全面的软件工具，这一需求已经通过文献中发表的许多算法得到解决。此外，所有市售的光谱成像共聚焦显微镜都配有先进的专有软件包，专门用于数据分析和使用仪器获取的数据。光谱图像的分析可以基于数据集中存在的光谱特征或图像特征（有时两者都有）进行，但大多数数学方法涉及统称为线性解混或线性分解的算法。lambda堆栈的软件分析可以应用于几乎任何荧光探针的组合，但是由吸收染料或反射光光谱特征组成的图像堆栈必须在应用线性解混算法之前转换为光密度。
为光谱图像分析设计的原始算法主要是为了将单个特征分配给卫星图像中捕获的物体而开发的。这类图像分析中最有用的数学方法被称为主成分分析（PCA）、监督分类分析（SCA）、多变量曲线分辨率（MCR）和线性分解（LU）。这些算法是基于这样的假设，即测量信号从每个波长（或颜色）是线性正比的百分比或浓度的波长在样品中。当吸收染料或荧光探针的浓度较低时，这种假设通常是正确的，但当浓度达到饱和水平时，结果可能明显偏离线性。在这种情况下，必须应用校正项。另一个需要明确指出的要点是，每个荧光团或吸收染料都具有独特的光谱特征，可以独立确定，以作为参考，将该探针或染料的适当贡献分配给lambda堆栈中的单个像素。在光谱图像分析开始之前，收集准确的参考光谱是任务的关键步骤。
在典型的基于荧光的光谱成像实验中，通常在样品中存在几个荧光团，每个荧光团标记不同的结构。在该标本的整个图像中，根据其在目标细胞器或大分子内的空间分布，可以单独或作为混合物发现荧光团。线性解混分析的目的是确定每个荧光团对图像的每个像素的相对贡献。在大多数情况下，正确使用该算法需要在单独制备的对照样品中记录实验中使用的所有荧光团的单个发射光谱。对照样品的制备应采用与测试样品相同的技术（如安装介质和细胞类型），并且必须使用与分析样品相同的仪器设置（增益、滤光片、物镜、激光功率等）进行记录。严格控制样品制备和记录参考光谱的重要性怎么强调都不为过。
线性分解λ堆栈的另一个重要标准是，所有荧光团的分离光谱必须彼此可区分，并且它们还必须是线性独立的，这样任何光谱都不能由其他光谱的线性组合产生。这一假设并非微不足道，因为线性标准可能会被未知或意外的相互作用所破坏，例如共定位荧光团之间的能量转移（FRET）、猝灭和环境波动。在这种情况下，FRET被认为是一种伪影，它可以导致供体荧光团的荧光发射强度降低，并伴有其光谱的轻微变化，同时也会导致受体荧光团的发射强度增加和潜在的光谱改变。然而，在任何情况下，FRET效应往往是非常小的，但应考虑成像荧光探针有可能经历FRET相互作用。作为一般的经验法则，线性解混软件表现最好时，使用样品，表现出高信噪比的所有荧光团被检查。
线性解混计算的基本概念相对简单。光谱图像中的每个像素被分类为代表荧光团信号（强度）的混合物，当测量光谱（I(λ)）可以反卷积成每个单独荧光团参考光谱（R(λ)）的比例，重量或浓度(C)时，将值求和。因此，一个纯荧光团的每个参考光谱被描述为Ri(λ)，其中i = 1,2,3.....n表示荧光团指数（Ci）。对于特定数量的荧光团(n)，此关系可表示为：
I(λ) = C1•R1(λ) + C2•R2(λ) + C3•R3(λ) + ........ + Cn•Rn(λ)
或者简化为：
I(λ) = ∑i Ci•Ri(λ)
在实践中，光谱图像中每个像素(I)的信号强度是在lambda堆栈采集过程中确定和记录的，已知荧光团的参考光谱是在使用相同的样品制备技术和仪器设置，仅用单个荧光团标记的单独对照样品中独立测量的。样品中各种荧光团的总体光谱贡献可以通过计算其对测量光谱中每个点的个人贡献来确定为简单的线性代数矩阵练习，如上述方程所述。对于许多市售的线性解混软件包，通过输入参考光谱轮廓并使用逆最小二乘拟合方法获得解决方案，该方法使测量光谱与计算光谱之间的平方差最小化。
图11-荧光发射光谱的加性特性
在应用线性解混算法时，为了保证获得成功结果的最佳机会，必须满足几个实验条件。最重要的考虑因素之一是确保光谱检测通道的数量至少等于样品中存在的荧光团的数量。不符合此规范可能导致光谱分离计算的多个解决方案，并且可能无法获得唯一的结果。线性分离的另一个关键要求是，在计算中必须考虑标本中存在的所有荧光团，否则结果可能会向优势（最浓缩）荧光团倾斜，而牺牲较不浓缩的物种。具有讽刺意味的是，在计算中包括与lambda堆栈中的任何荧光团不匹配的光谱将不会影响线性解混结果（将为缺失的荧光团分配零贡献）。最后，自体荧光和/或高背景水平也应在光谱上定义（如果可能的话），并作为额外的荧光团处理，以获得最佳结果。可选地，还可以计算误差项并作为误差残差图像输出。
添加荧光团光谱所涉及的线性关系如图11所示，这是两种不同但高度重叠的假想荧光团的混合物，其发射最大值位于黄橙色（荧光团1）和橙红色（荧光团2）光谱区域。图11(a)至11(c)中的黑色曲线表示两种荧光团在不同浓度下的光谱总和：图11(a) 1至1；图11(b) 0.5 ~ 1；和图11(c) 1至0.5。尽管图11中所示的光谱仅代表了三种荧光团组合的示例，但通过简单地将强度作为浓度的函数相加，可以很容易地预测这两种荧光团的每种可能组合的总光谱。请注意，总和光谱的峰值随着组成荧光团的比例而变化，图11(a)的最大值为594纳米，图11(b)的最大值为598纳米，图11(c)的最大值为589纳米。应该强调的是，线性解混利用的是整个光谱曲线，而不仅仅是峰的位置。强大的算法，如在光谱核型和共聚焦显微镜中使用的算法，也可以通过复杂的曲线分析和校正来处理微小的光谱位移。
当分析用两个荧光团标记的样品的光谱含量时，类似于图11所示，最简单的方法是将来自任何特定像素的求和光谱与光谱参考库中所有可能的求和组合相匹配。作为一个例子，如果测量的和光谱是非常接近的匹配，在图11(a)所示的黑色曲线，这将表明像素包含50%的贡献从每个荧光团，他们是均匀地混合在样品中（至少对于该像素）。同样，如果求和光谱与图11(b)中的黑色曲线相匹配，则可以假设像素包含66%的荧光团2和33%的荧光团1。因此，可以总结，线性解混是通过将表示图像中测量的和光谱的矩阵与根据软件应用的最佳拟合参数预测光谱的参考库进行比较来操作的。一旦确定了每个荧光团的光谱贡献，就可以将λ堆栈划分为每个荧光团的单独图像，如图12所示。
图12(a)和图12(b)分别是一对光谱混合和未混合的图像，分别是对数相印度鹿皮肤成纤维细胞的贴壁培养，这些细胞被固定在多聚甲醛中并标记为SYTOX Green（核），Alexa Fluor 488结合到phalloidin（丝状肌动蛋白），Alexa Fluor 514结合到山羊二抗，靶向兔一抗PMP-70，一种过氧化物酶体膜蛋白（过氧化物酶体）。使用尼康C2+共聚焦显微镜收集470至550纳米波长范围内的发射，使用2.5毫米衍射光栅耦合488纳米氩离子激光器激发（图12(A)）。λ堆叠是线性未混合和伪彩色的(核；红)、(肌动蛋白;蓝色)，过氧化物酶体（绿色）生成图12(b)所示的最终图像。图12(c)和图12(d)所示的明场图像是用伊红和苏木精染色的人肝组织固定标本获得的。使用配备chromecdynamics (Gooch and Housego) HSi高光谱成像探测器和Andor iXon EMCCD的尼康80i显微镜捕获混合样品的明场图像（图12(c)）。线性分解后，通过分配假颜色，用两种染料标记的样品的特定区域更清楚地可识别（图12(d)）。
图12-荧光和亮场光谱成像
虽然光谱成像和线性解混正在成为激光扫描共聚焦显微镜中分析光谱重叠荧光探针复杂混合物的重要工具，但该技术也越来越多地应用于用吸收染料染色和传统明场显微镜成像的病理组织和细胞标本的测量。为了对吸收性染料进行线性解混分析，可以在数据过滤后使用类似的算法来补偿适用于吸收而非发射光谱的因素。与荧光测量相反，明场分析技术要求为每个像素收集的吸收数据必须与通过样品传输的光源的光谱剖面分离。实际上，透射光照明必须作为附加参考来测量。合成染料的吸收光谱与浓度呈线性关系（由比尔-朗伯定律决定）。在数学上，吸收染料的线性分解计算与荧光探针的计算类似，可以用下面的公式表示：
A(λ) = ∑i εi(λ) • Ci • Li
其中，根据Beer-Lambert方程，A是染料种类(i)的吸光度，Cis是浓度，L是标本光路长度，通常以微米为单位测量染色组织切片。在进行计算之前，必须从测量的透射值确定每个吸收种的光密度。应当注意的是，传输数据转换为光密度会导致在特定吸收物质的信号电平较低时引入显著的噪声电平，从而使解混结果复杂化。在这种情况下，光谱分析最好只包括峰附近的吸收区。与荧光探针线性分离的情况类似，如果已经独立确定了合适的参考吸收光谱，则可以计算图像中每个像素的样品中每种染色剂的浓度。
在比较明场吸收染料光谱成像与荧光模式下进行的光谱成像时，吸收染料标本通常不会随着时间的推移而褪色，而检查荧光标本的行为可能导致光漂白。用吸收染料染色的标本通常具有0.05至小于2.0光密度（OD）单位的动态范围，其中0.05 OD与背景几乎无法区分，2.0 OD单位对应于大约1%的光透射，这是相对较暗的。如果聚光镜数值孔径光圈调整不正确，吸收图像也会由于眩光而产生分布误差。此外，吸收染料成像也需要对整个成像系统有透彻的了解。例如，如果标准钨卤灯发出的近红外光（热）没有被阻挡（实际上，波长大于720纳米），它可以被CCD相机系统检测到，并作为噪声添加到强度计数中。理想情况下，应该在光路中包含一个具有紫外和近红外阻挡的宽带通滤波器，以去除不需要的波长。吸收染料成像的进一步限制是，最大曝光时间必须小于探测器饱和所需的时间。相反，荧光曝光时间通常受到检测器热噪声的限制。
光谱成像应用
光谱成像为研究各种应用中的现象提供了必要的基础和工具，包括活细胞成像、核型分型、常规荧光成像、药物发现、检测分子相互作用和组织病理学。收集所研究分子的部分或完整光谱信息的能力使混合荧光团和吸收染料的检测和区分成为可能，即使在探针表现出相似的颜色和高度重叠的光谱剖面的情况下也是如此。这项强大的技术使研究人员能够在细胞和组织中标记多个目标，并确保在图像分析过程中不会干扰出血和明显的共定位。此外，光谱成像所提供的信息与线性解调相结合，可用于区分由固定液、转染试剂和安装介质折射率波动产生的合法信号和伪影。光谱成像也成为消除自身荧光和监测共振能量转移引起的动态分子相互作用的重要方法。
基于荧光原位杂交技术的光谱核型分析是光谱成像技术中最受欢迎的应用之一，已被广泛接受。在一个典型的实验中，多达五种不同的荧光团被用来标记24条人类染色体中的每一条，这项技术也可以应用于其他物种的染色体。每条染色体都用不同的荧光团组合标记，如Cy5、FITC、罗丹明、Alexa荧光染料之一或任何ATTO染料。组合标记产生2N - 1种可能的组合。因此，仅使用5个荧光团的总清单就可以产生31种可能的双染料组合，这些组合可以很容易地用分析软件识别（见图13(a)）。在分析过程中，对图像进行扫描以获取波长的空间分布，进行分割，然后根据五个荧光团光谱的参考库和每个染色体的已知荧光团组合表对每个像素进行分类。分类分析的结果通常以不同的颜色显示，每种颜色代表不同的染色体（如图13(b)所示）。所获得的光谱数据的高特异性使得在大多数染色体制备中成功分类，即使使用复杂的组织切片。通过将第六种染料偶联物添加到特定区域的探针上，或添加到所有短染色体臂的探针上，可以获得用于自动核型的额外信息。在实践中，光谱核型通常与DAPI带相结合。
在FRET显微镜中遇到的复杂信号是混淆了光谱重叠的过量，这是需要的荧光团，以便进行共振能量转移。因此，除了光谱成像在多色固定细胞和活细胞中分离荧光团光谱的能力外，该技术还特别适用于在FRET成像中揭示供体和受体荧光团的发射贡献。配备多阳极探测器的现代高性能共聚焦显微镜特别适合FRET分析，因为它们的图像捕获率高，这在研究毫秒时间尺度上操作的荧光蛋白生物传感器时通常是必要的。32通道多阳极探测器，光谱成像共聚焦显微镜可以获得整个光谱响应从两个FRET荧光团在一次扫描。然而，尽管光谱成像能够在FRET中同时检测两种荧光团发射信号，但该技术无法区分通过能量转移产生的受体发射和来自直接激发的信号。因此，使用分别表达的供体和受体蛋白进行适当的对照是定量分析的必要条件。在使用光谱成像来评估荧光蛋白生物传感器中表达为单个多肽的FRET的情况下，对照不太重要。
图13-光谱成像中的核型分析和自体荧光去除
在活细胞成像过程中，导致信噪比降低的最关键的伪影之一是自身荧光，它有许多来源，包括天然荧光生物分子（如NADH、核黄素和弹性蛋白）、DNA转染试剂、培养基和添加到成像介质中的外源性试剂（药物和生化物质）。当用多聚甲醛制备的细胞和组织成像时，固定物诱导的自身荧光也特别成问题，并且该伪影可能干扰特定组织（脑和皮肤）的全身成像。此外，植物组织倾向于在整个可见光谱区域表现出高度的内在自身荧光。光谱成像最强大的应用之一是消除用弱发射荧光团标记的标本或那些具有稀疏靶向的标本的自身荧光。在大多数情况下，自体荧光可以作为一个独立的荧光团处理，具有独特的光谱特征（最容易在对照样品中确定），可以从感兴趣的信号中分离出来，从而从最终图像中减少或完全消除(见图13（c)和13(d)）。值得注意的是，在活细胞成像中，自身荧光的水平在较长波长下会降低，因此仔细选择在橙色和红色区域发射的荧光团可以帮助减少这种伪影。
病理标本用多种吸收染料染色，在明场照明下成像，是光谱成像和宽视场显微镜线性分解的优秀候选人。许多用于染色细胞涂片和组织切片的常见合成吸收染色剂和染料表现出具有显著重叠水平的复杂光谱。然而，在明场成像中，信号通常很强，光漂白很少或不存在。光谱成像可用于用几种染料标记的明场标本，以产生单独的图像，显示仅用一种染料染色时标本的外观。然后可以进行后处理，以确定特定结构内染料的共定位。在对明场标本进行光谱成像时，最严重的伪影发生在成像染料中含有散射而不是吸收光的沉淀物，或者细胞和组织被过度染色时。
光谱成像的实用方面
在利用仪器功能和软件参数优化实验方案的情况下，光谱成像和线性解混技术有可能产生出色的结果，确保不会无意中引入有害的伪影。简而言之，大多数光谱成像实验的成功或失败往往是由研究者控制的变量决定的。最重要的（也是最关键的）方面是从对照荧光团样品中获得准确的参考光谱，忠实地代表真实的光谱剖面。此外，必须非常小心，以确保在相同的条件下制备对照和测试样品，包括荧光团浓度、培养基、固定液、洗涤缓冲液、安装介质以及玻片和盖片的光学质量。对照物和待测标本的仪器参数也应相同。这些包括使用相同的物镜、浸没油、激光功率、光电倍增管设置、针孔直径、二色镜、波长扫描范围和像素停留时间。在理想条件下，在荧光团的空间分布允许的情况下，可以在测试样品的非重叠区域获得参考图像。
尽管先进的线性解混算法能够分辨具有显著重叠程度的荧光团的光谱，但大多数软件包区分具有几乎重叠光谱的荧光团的能力受到限制。这种现象很少发生，通常只出现在密切相关的荧光蛋白和合成染料衍生物中。例如，Alexa Fluor 488和荧光素都是具有相似取代基的杂蒽衍生物，主要区别在于前者磺化以增加溶解度。这两个荧光团的光谱峰只相隔一个纳米，发射曲线几乎完全重叠。因此，不可能区分Alexa Fluor 488和荧光素使用光谱成像和线性解混。但是，请记住，这是一个不寻常的情况，大多数用于标记细胞和组织的常见荧光团可以使用这种强大的技术很容易地解决。
对照和测试标本中荧光蛋白的荧光团浓度和/或表达水平尽可能接近，将有助于确保光谱成像结果令人满意。一般来说，研究人员应该努力达到尽可能高的信噪比。由于光谱成像仪器中单个通道的带宽范围约为2至10纳米，因此仪器的灵敏度总是受到能够在每个波长波段与探测器注册的光子数量的限制。因此，只有在使用带有明亮荧光团标记的标本时，才能在5纳米或更小的分辨率下实现可接受的荧光团光谱分离。不幸的是，在非常高的分辨率下（低于5纳米），典型的生物标本往往表现出较差的信噪比和图像质量，当用荧光团标记时，非常暗淡或有稀疏的目标。因此，当检测通道宽度尽可能大时，可以获得最佳的线性解混效果。
在光谱成像中的其他实验问题是高背景电平，过多的检测器和光学系统噪声，和自身荧光。高背景可能发生在不正确定位的荧光团、过度染色、激光线噪声、安装介质不均匀、浸入油不匹配、杂散光和自身荧光。在大多数情况下，可以在光谱数据收集后使用减法技术降低背景电平。探测器和光学噪声成为成像弱荧光探针时的问题，但往往可以有效地消除通过减少检测通道的数量和扫描在较大的带宽。在线性解混过程中，自体荧光最好通过将其作为具有不同光谱剖面的单独荧光团通道来处理。总之，仔细注意仪器配置细节、样品制备技术和最佳荧光团的选择是光谱成像实验成功的关键。
