在荧光实验中，荧光团会在基态和激发态之间不断进行能级跃迁，并在返回基态时发射荧光（见图1）。通常情况下，一个荧光团可以在被破坏之前经历数千次的这种循环过程，这也是荧光方法具备极高灵敏度的原因。需要注意的是，由于存在多个导致激发态能量释放的过程（如图1a所示），发射的荧光光子的能量通常小于激发光的能量。这种能量从短波长到长波长的转移称为斯托克斯位移（如图1b所示），斯托克斯位移对灵敏度至关重要，因为通过滤光片过滤激发光，可以有选择性地只检测发射光光子。
荧光团的分子亮度（B）定义为单个分子每秒发出的光子数。这个值并非分子的固有属性，因为它受到激发强度、光收集和检测仪器效率的影响。然而，它与激发波长处的摩尔消光系数（ε）和分子的荧光量子产率（QY）的乘积成比例。
B ≈ ε × QY
在大多数应用中，获取光子数量的多少直接影响了数据的质量。虽然在许多实验中可以通过增加荧光团浓度或提高激发强度来弥补低亮度的影响，然而，在某些情况下，比如荧光显微镜应用中，高强度激发光可能导致背景信号增加、检测污染和荧光团稳定性下降，因此无法大幅度增加激发光的强度，所以在此类应用中需要荧光团具备较高的亮度，B值越高，所需的激发光强度便越低。在另一类应用——荧光分子标记中，标记的亮度可以通过增加染料与大分子的化学计量比（D：M）来弥补。然而，这种策略的缺点是大量的荧光分子可能会影响标记分子的结构或相互作用模式。例如，在标记的抗体中，增加标记程度（DOL，即每个抗体的荧光团数）可能会导致抗体亲和力急剧下降。此外，在一些特定的应用领域，提高D：M化学计量的策略可能不可行。因此，在这种情况下，强烈建议使用具有高ε和QY值的荧光探针，以确保足够的荧光光子计数。
分子的摩尔消光系数（以M-1cm-1为单位）描述了在给定波长下的光吸收能力。荧光团的光吸收截面（σ）描述了分子的光子捕获面积，并使用公式计算：
σ = 3.82 × 10-5ε (in Å)
以荧光素为例，其在490 nm 处的摩尔消光系数为75,500 M-1cm-1，通过计算得到其光吸收的横截面值为2.88 Å2，这个值明显小于其分子尺寸。因此，通过计算其分子吸收截面可以得知只有一小部分荧光团遇到的光被有效地吸收了。
图2. 常见荧光染料的最大吸收波长与摩尔消光系数
荧光量子产率（QY）是一项指标，用于衡量荧光团分子在受激发后发射光子的效率，即发射光子数与吸收光子数的比值。由于荧光团分子可以通过非辐射过程返回到基态，所以QY的值一般不会超过1。以荧光素为例，其在490 nm波长处的量子产率为0.93，这种高QY值是使荧光素成为流行的荧光团之一的原因之一。
图3. 荧光量子产率
荧光团周围的电子供体会显著降低某些荧光团的量子产率，如一些氨基酸（色氨酸，以及较小程度的酪氨酸、甲硫氨酸和组氨酸），它们通过不同的静态和动态淬灭方式降低了许多荧光团的量子产率。但是，一些特定的花菁类荧光团，如Cy3、Cy5或Alexa Fluor 647（AF 647），对这些氨基酸的分子内淬灭不太敏感。对于标记的寡核苷酸，也观察到了类似的荧光团猝灭现象，即特定的核苷酸（如鸟苷）诱导其紧邻的几种荧光团显著猝灭。同时，恶嗪衍生物，例如ATTO 655和ATTO 680（图2和3）对这些效应特别敏感，因此虽然这些荧光探针不能用于蛋白或者氨基酸多多肽的标记，但是可以用于检测与标记肽的肽-抗体相互作用。
选择荧光探针时，其中一个最关键的考虑因素是光稳定性，特别是在用于成像应用时。实际上，在荧光显微镜中，定义荧光强度的最主要限制因素之一是荧光团在连续照射期间不可逆的光化学破坏，也称为光漂白。光漂白的速率，即荧光团在被破坏之前可以发射的光子数量，决定了采集期间荧光发射随时间减少的程度。荧光团在其使用寿命期间通常能发射104至106个光子，然而，在光漂白之前，某些分子可能只能发射约1,000个光子。例如，荧光素在光漂白之前能在水中发射30,000到40,000个光子，但在实验期间只有一小部分光子能被收集。光漂白的机理尚不完全清楚，但与分子氧的相互作用被认为是光灭活的主要原因之一。在荧光团转变为长寿命的三重态时，分子会在激发态中停留相当长的时间（以毫秒计），从而容易与氧和其他分子发生不可逆的化学反应。为了最小化光漂白，可以使用由活性氧清除剂组成的抗漂白剂，或者通过降低三重态形成程度来减小分子与氧发生反应的可能性。在荧光显微镜应用中，选择具有强光稳定性的荧光团是至关重要的。尽管目前没有用于准确预测染料光稳定性的规则，但在相同的化合物家族中，荧光团的延伸和柔性通常伴随着较低的光稳定性。一些罗丹明类染料因其刚性结构而具有较高的光稳定性，例如Alexa、DyLight、ATTO、HiLyte和Janelia染料。这些染料通常显示出较低的漂白率，例如AZ3000。
对于需要在较短波长下发射的应用，通常使用香豆素。然而，香豆素衍生物的光稳定性通常低于基于罗丹明的化合物。在选择荧光团时，应避免对光氧化敏感的染料，如Cy类花菁染料，但可以考虑使用碳吡喃酮等具有非常高光稳定性的染料，例如ATTO 647和恶嗪衍生物，如ATTO 655、ATTO 680和ATTO 700。尽管光漂白通常不被期望，但在某些情况下，例如在光漂白后的荧光恢复（FRAP）或光漂白中的荧光损失（FLIP）实验中，光漂白实际上可以用于研究分子扩散速率。
今天给大家分享了《生物学中的荧光光谱学和显微技术》第一章中关于荧光小分子的一点内容，主要是理想的探针需要具备的哪些特性，包括亮度、摩尔消光系数、量子产率、光稳定性等，下期将继续为大家介绍聚集和溶解度、发射光谱、斯托克斯位移及荧光寿命等。
Sarmento, M. J.; Fernandes, F. Choosing the Right Fluorescent Probe. In Fluorescence Spectroscopy and Microscopy in Biology; Šachl, R., Amaro, M., Eds.; Springer International Publishing: Cham, 2022; Vol. 20, pp 3–51. https://doi.org/10.1007/4243_2022_30.
