Aggregation and Solubility

荧光团浓度的递增并非总是与荧光强度成正比。这是因为荧光团的自灭现象可能削弱共轭荧光团的量子产量。在某些情况下，分子内部的自灭现象可能相当显著，即使在中等程度的染料标记下也难以避免。例如，在使用Cy 5对蛋白质进行非特异性共价标记时，已与蛋白质结合的Cy 5标记物周围的官能化区域可能会促使形成Cy5簇。因此，在相对较低的Cy5/蛋白质比率下，由于静态自灭导致的Cy5量子产量急剧下降，多个标记的蛋白质显示出比单个标记的蛋白质更低的荧光。这种现象是由于Cy5具有二聚化倾向，形成非荧光复合物所致。然而，像Alexa Fluor 647和4S-Cy 5这样花菁染料则是例外，因为它们携带的四个磺酸酯基团增加了染料之间的互斥作用。

Fluorescence Emission Spectra

荧光团的发射光谱范围对于实验结果和设备选择都至关重要。在选择荧光团时，需要考虑到所用设备的检测限制，比如滤光器组合的限制。光电倍增管探测器在700 nm以上的光子探测效率明显下降，这也限制了可用探针的范围在UV-VIS范围内。

因此，可见光发射在380 nm和750 nm之间的荧光团非常受欢迎。这些荧光团可以有效地被光电倍增管探测器探测到，并且在生物样品中自发荧光的情况下也表现出较好的稳定性和信噪比。此外，这些荧光团还可以用于标记生物分子并进行成像研究。

总之，荧光团的发射光谱范围是选择荧光团时需要考虑的重要因素之一，而可见光发射在380 nm和750 nm之间的荧光团因其广泛的应用前景和良好的性能表现而备受推崇。

在含有多个荧光团的实验中，精确隔离单个信号非常关键。对于依赖于光学滤波器的成像应用，多个荧光团的发射光谱可能重叠，导致一个分子的荧光信号在另一个分子的检测通道中出现（串色）。为了避免荧光团之间的串色，可以采取以下措施：

Stokes Shift

Stokes位移是指在荧光光谱中，样品发射的荧光光波长比激发光波长长的现象。这种位移通常表现为发射光的波长较大（波长增加），这是由于分子在吸收能量后重新排列并发射荧光时所产生的。Stokes位移在荧光分析和光谱学中非常重要，因为它允许我们检测和分析荧光信号，同时避免激发光的干扰，提高了信号的特异性和分辨率。

但是，已经提到的大多数常用的荧光物质（如黄酮类、BODIPY和花菁衍生物）具有较小的斯托克斯位移。小斯托克斯位移的另一个影响是激发光谱和发射光谱之间的重叠增加。因此，具有小斯托克斯位移的荧光团容易受到homo-FRET的影响。在典型的FRET中，供体和受体是两个不同的分子，而在homo-FRET中，供体和受体共享相同的结构。这对于检测同源寡聚化或聚类非常有用。一些BODIPY衍生物具有特别小的斯托克斯位移，因此已广泛用于homo-FRET研究 。

Fluorescence Lifetime

荧光寿命是指某种物质被一束激光激发后，该物质的分子吸收能量后从基态跃迁到某一激发态上，再以辐射跃迁的形式发出荧光回到基态。当去掉激发光后，分子的荧光强度降到激发时的荧光最大强度 I 0 的1/ e 所需要的时间，常用τ表示 。

大多数探针的荧光寿命在1-6纳秒之间。值得一提的是，花菁衍生物如Cy5的荧光寿命低于1纳秒，而芘则具有数百纳秒的寿命。

荧光寿命与荧光团浓度无关，因此提供了非常可靠的测量结果。在活细胞中，利用荧光寿命进行FRET成像不需要进行基于强度的方法所必需的大量校准和图像处理，因此对于分析活细胞中蛋白质的相互作用非常有帮助。这种特性使荧光寿命成为研究生物分子相互作用和环境的强大工具。

对于某些探针，荧光寿命在很大程度上取决于荧光团的局部环境，因此可用于检测大分子的构象变化。例如，Hoechst 33342或ATTO 655可用于检测双链DNA的存在，因为染料与双链结合会增加激发态的寿命。通过测量荧光寿命变化，可以检测蛋白质-DNA相互作用。类似的基于BODIPY的分子可用于量化线粒体膜粘度，因为其荧光寿命的增加反映了膜中流动性的降低。

荧光寿命测量可以采用脉冲（时域）或调制激发光源的方法。当使用脉冲激发时，需要确保待测量的荧光寿命明显短于激光器的重复频率。例如，在钛蓝宝石激光器中，其重复频率约为80 MHz，相当于两个脉冲之间的间隔为12.5 ns。因此，如果样品中的荧光团寿命明显长于3纳秒，那么在新脉冲到来之前，样品中仍可能存在激发的荧光团，导致衰减不完全和寿命估计错误。为此，建议用于荧光寿命测量的染料的寿命至少应短于激光的重复频率的四倍。

pH Sensitivity

在选择荧光团时，特别是在不涉及pH值估算的特定应用中，应该选择对pH值不敏感的荧光团。尽管大多数市售的探针不受pH值影响，但也存在几个明显的例外，比如荧光素，荧光素的信号受pH值影响非常大，因为其结构上酚羟基的pKa值为6.4。在接近中性pH值时，单负离子形式（ε = 29,000-32,600 M-1 cm-1，QY = 0.36-0.37）与双负离子形式（ε = 76,900-87,600 M-1 cm-1，QY = 0.92-0.95）处于平衡状态。由于这两种形式的光物理特性存在较大差异，因此，在分析荧光素或荧光素标记的共轭物的数据时，必须考虑到pH这一点。荧光素的pKa值接近大多数生物系统的pH值，这对多种应用不利。因此，人们开发了几种具有不同pKa值的衍生物。例如，俄勒冈绿的pKa值为4.8，这消除了大多数生物系统对pH值的敏感性。与此同时，荧光素对pH值的依赖性使其成为pH传感器的候选者。在1982年，Roger Tsien推出了一种荧光素的衍生物——7'-双（2-羧基乙基）-羧基荧光素（BCECF），其pKa值更接近7（6.98），更适合用于感知细胞内的pH值。但是该分子中额外的羧基大大降低了染料的膜透性，因此在荧光团上添加乙酰氧甲基（AM）酯基团来实现细胞方面的应用，这种酯基团可以增加分子的穿透性，但会在细胞内被酯酶水解，导致染料在细胞内积累。到目前为止，BCECFAM仍然是最常用的细胞内pH传感器之一。