图 1 生命科学应用中常用的外源荧光探针类别。

表1. 常见的荧光染料性质及应用

香豆素家族化合物分子中含有2H-chromen-2-one基团，可以说是小型有机染料中的最大群体。香豆素具有光稳定性、量子产率和显著的斯托克斯偏移等卓越特性，因此被广泛应用于生命科学领域。香豆素的蓝色发射特性使其成为多色成像的理想选择，且可与绿-红外染料组合使用。然而，在细胞成像中，香豆素可能与自发荧光信号重叠，这是其短波长激发特性的缺点之一。另外，香豆素的亮度有一定限制，如AF350，这是由于其较弱的吸收能力所致。在过去几十年中，香豆素荧光分子已经被广泛应用于生命科学领域。最近，π-扩展荧光香豆素（PC6S）成功应用于荧光寿命成像（FLIM）技术，实现了对活细胞和活小鼠组织中脂滴的高分辨率成像。此外，研究人员还在积极寻求其他替代选择，例如笼状衍生物。这些衍生物能够在可见光和近红外光范围内被激活，而重氮香豆素衍生物则可以在受到可见光或近红外光照射后的光激活（解笼），实现对活细胞中特定蛋白质的有选择性荧光标记。这些新的应用展示了香豆素荧光染料在生命科学领域不断发展的潜力和前景。虽然香豆素的短波长激发特性可能存在一些缺点，但香豆素仍然是一种广泛应用于各种生命科学研究中的有效染料。未来，我们也可以期待更多针对香豆素的研究，以便最大化其使用效果。

在这个类别中，我们可以找到有机染料中的最亮荧光团。虽然花菁类染料通常具有较低的量子产率（≤0.25），但它们的消光系数非常高。花菁衍生物的化学结构包含具有季铵氮的共轭聚次甲基链，通过调整功能基团和共轭链的长度，研究人员可以大幅度地调整荧光团的光物理性质。然而，正如之前讨论过的，花菁类染料的使用可能受到光漂白的限制，并且它们的斯托克斯位移较小（对于超分辨率显微镜技术可能很重要）。此外，Cy5和Cy7衍生物在氧气和臭氧的存在下容易氧化，从而限制了它们在需要长时间测量的实验中的应用。最近，研究人员通过开发新的衍生物，提高它们的量子产率并增加其氧化抗性，在一定程度上克服了花菁类染料存在的问题，因此，花菁类染料也被开发成荧光探针用于在活细胞中检测和标记汞、DNA和RNA等，此外，随着单分子定位显微镜技术的发展，花菁类染料已经越来越多的被应用于生物成像中。

图2. 花菁类染料的合成

如之前提到的，荧光素和罗丹明都属于氧杂蒽染料，自首次合成以来在各个领域得到了广泛应用。它们之所以备受欢迎，主要是因为它们具有极高的亮度，并且其激发和发射波长都位于可见光谱范围内。不过，荧光素的pKa值为6.4，因此其光谱特性在很大程度上受环境pH值（在5-9之间）的影响。此外，它们的光稳定性也有限。多年来，荧光素和罗丹明的衍生物层出不穷，应用领域也是多种多样的。其中，最常见的荧光素衍生物包括异硫氰酸荧光素（FITC）、羧基荧光素、5/6-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯、脒基荧光素（FAM）和二乙酸荧光素。至于罗丹明，罗丹明6G、110、123以及罗丹明B是使用最广泛的类型，还有一些罗丹明衍生的Alexa Fluor染料。在进行活细胞成像时，这些染料的特性，如渗透性、定位和聚集状态，很大程度上取决于每种衍生物的结构特征。

图3. 罗丹明染料的合成

二吡咯烷硼化合物，或称为BODIPY，因其卓越的光物理特性而备受欢迎。它们具有高量子产率、出色的亮度、窄半峰宽的吸收和发射光谱，以及较小的斯托克斯偏移等特点（表1）。使用BODIPY染料的主要限制可能是其易氧化性。BODIPY的各种衍生物覆盖了从绿色（BODIPY FL）到红色（BODIPY 650/665）的大部分可见光谱范围。基于BODIPY的荧光探针广泛应用于生物医学和环境科学领域。举例而言，BODIPY染料可以用于追踪细胞内的钙离子浓度变化，以揭示神经元活动或细胞信号传导路径。此外，它们还被用作药物递送的标记，将药物与BODIPY结合，以监测药物释放过程，这在药物研发中具有重要价值，可帮助优化药物递送系统。这些应用突显了BODIPY荧光探针在生命科学和医学研究中的重要性，以及它们在开发创新解决方案方面的潜力。

图4. BODIPY染料的合成