在研究荧光机理的时候，我们永远绕不开Jabloński Diagram，它可以用于解释和可视化分子或原子的激发态和跃迁过程，Jabloński Diagram是由亚历山大-雅布隆斯基利用弗兰克-康顿原理详细解释了分子液体溶液发光的主要特征，并在1933年绘制的。随后，雅布隆斯基与卡沙、刘易斯和泰瑞宁一起进一步研究，证明了发射过程中涉及的能级的单线态和三线态特性，并为荧光、磷光和延迟荧光提供了具体的术语。
这张能级图清晰地说明了在光物理过程中，荧光团在激发和回到基态过程中的典型行为。
能级示意图：雅博隆斯基图通常以垂直的能级示意图的形式呈现。
在图中，纵轴表示能级，通常有两个轴，一个表示能量（能级），另一个表示光的波长或频率。
激发态和基态：在图中，最底层的水平线代表分子或原子的基态，而上方的水平线代表激发态。
分子可以从基态跃迁到激发态，然后再跃迁回基态。
吸收和发射：雅博隆斯基图用于解释吸收和发射光谱。
吸收发生在分子从基态跃迁到激发态时，而发射发生在分子从激发态跃迁回基态时。
能量差和波长：通过测量激发态和基态之间的能量差，可以计算出吸收和发射的波长。
在正常实验室或生理温度下，生物样本中的大多数荧光团都处于振动松弛（v = 0）的最低电子基态S0。当吸收一个足够能量的光子时，分子将转移到更高的电子激发态，同时也引发振动激发。由于振动弛豫速度非常快，多余的振动能量通常会通过分子碰撞而耗散。通过发射光子（即荧光），分子失去了大部分吸收的能量，并回到了电子基态的振动激发水平。之后，快速进行振动弛豫，再次形成电子基态的最低能级。
然而，在荧光光谱学中，我们观测的是吸收和发射光子的能量，或者更准确地说，是这些光子能量的分布。雅布伦斯基图中，箭头的长度与吸收或发射光子的能量成正比。因此，与吸收光谱相比，典型的荧光发射光谱会发生红移（向较低能量方向移动）。这种光谱偏移称为Stokes位移（Stokes shift）。
从Jabloński Diagram中可以看出，造成Stokes位移的原因主要由两种，他们分别是弛豫震动和内转换，弛豫震动在前文已经介绍了，那么这里介绍一下内转换。
内转化是指分子在不发射辐射的情况下进入更低电子态的过程，它涉及到两个拥有相同自旋态的状态之间的跃迁，即从单线态到单线态或从三线态到三线态（单线态到三线态的跃迁成为系间穿越）。内转化的效率在两个电子能级非常接近时更高，就像在S1和S2之间所示。内转化也可能发生在S0和S1之间，因为来自更高激发态的荧光导致能量损失，尽管这种可能性较低。对于一些分子来说，它们的基态振动能级与第一个激发电子态的振动能级重叠，这导致电子的快速快速失活。通常这种情况在脂肪族化合物（不含环状结构的化合物）中发生，这也是为什么这些化合物很少发出荧光的原因。
需要指出的是，除了内转化和震动弛豫之外，还有一种因素会造成Stokes位移，这便是溶剂弛豫。在流体介质中，激发态周围的溶剂弛豫也会导致激发态的能量降低，溶剂弛豫是指分子在激发态（通常是电子激发态）中发生的过程，在分子吸收光子并跃迁到激发态时，分子的几何结构可能会发生变化（激发态荧光团的偶极矩大于基态荧光团的偶极矩），例如键角、键长等可能发生振动。这些振动会导致周围的溶剂分子重新排列以适应这些变化。这个过程通常发生得非常快，通常在飞秒（百万分之一秒）或皮秒（万分之一秒）的时间尺度内完成，因为溶剂分子在这个过程中吸收了一部分能量，所以分子在激发态的能量逐渐减小，这种能量的耗散是非辐射性的，因为它不会导致光子的发射，但是会降低激发态的能量造成斯托克斯偏移。溶剂弛豫是许多光谱学现象的重要组成部分，包括荧光光谱和磷光光谱，它对于理解分子在激发态中的行为以及光谱学的解释同样非常重要。
Fluorescence as a Reporter of Molecular Properties and Interactions
最初，荧光光谱的研究主要用于深入了解有机分子和生物大分子，以获取关于分子电子状态能量和转换速率等方面的信息。随着仪器技术的飞速发展，尤其是稳态和时间分辨荧光仪的出现，研究者开始更加关注荧光分子与其周围环境之间的相互作用，以及这些相互作用如何影响荧光的各种可观测特性。
Excitation
Intensity Iexc at the given wavelength
Excitation spectral profile Iexc = Iexc(λ)
Polarization (often linear, sometimes circular, sometimes undefined)
CW or pulsed, constant or modulated
Pulse time profile and pulse repetition rate
Single-photon excitation (this is the most common modality)
Two-photon excitation and entangled two-photon excitation
Excitation by structured multi-mode light
Excitation beam geometry, mode structure
Excited sample volume – bulk or confined to a diffraction-limited spot
(volume)
Fixed position or scanning
Fluorescence
For a fixed excitation intensity and excitation wavelength:
Total fluorescence intensity within a given emission wavelength region
Total anisotropy
Emission spectrum: Iem = Iem(λ)
Emission polarization or anisotropy spectrum
For variable excitation wavelength at constant excitation intensity
Excitation spectrum at λem = constant; emission intensity is a function of excitation wavelength, Iem = Iem(λexc)
Fluorescence quantum yield
Excitation polarization or anisotropy spectrum
Under pulsed or modulated excitation
Fluorescence intensity decay
Fluorescence anisotropy decay (depolarization)
Various fluorescence decay parameters, e.g., multi-exponential, energy transfer model
With spatial resolution
Emission intensity map
Emission spectral map
Intensity decay (lifetime) map, FLIM
根据上述需要考虑的荧光测量参数列表，所需的仪器设备范围可以从简单到复杂不等，具体取决于期望从哪些荧光参数中获取新信息。当前，荧光分子（或分子结构内的荧光亚基）主要被用来报告分子内和/或分子间相互作用，因此荧光动力学参数通常是最关键的。因此，即使在传统的生物化学和分子生物学实验室中，也越来越多地使用具有高时间分辨率的精密仪器。分子的荧光是指当它从激发态（通常是 S1）过渡到电子基态的各种振动水平（即 S1,0 → S0,v）时所自发辐射出的光。长期以来，研究者主要关注荧光的核心特性，包括发射光谱（即发射强度随波长的分布）、荧光量子产率、光谱的对称性和斯托克斯位移。随着时间的推移，对荧光寿命的研究也逐渐兴起。这一研究方向的转变使人们更加注重激发和发射荧光的参数，这些参数能够提供关于荧光分子与其分子环境（无论是溶剂还是更复杂的生物分子结构中的其他组分）之间相互作用的重要信息。在这些研究中，荧光分子变得更像是环境的“报告者”，传达有关其周围环境的信息，而不仅仅是作为独立的研究对象。这一新的研究重点促进了我们对分子与其环境相互作用的理解，从而深化了荧光光谱学的应用领域。
