在测量稳态荧光激发和发射光谱后，最关键的分子荧光特征（参数）之一是荧光衰减动力学。在最简单的情况下，我们假设激发态的弛豫是由相互独立的自发过程所主导，每个过程都可以用一个伪一阶速率常数 k 来描述。

如果假设成立，那么荧光衰减就是指数型的，从这种测量中可以提取的参数就是衰减的速率常数。实际上，这意味着要测量荧光寿命。自发荧光衰减是一阶过程,荧光（辐射）速率常数 k_F 是每个荧光团独有的基本分子参数。如果荧光是激发态的唯一衰减过程，那么测得的激发态寿命就是 τ_F = 1/k_F，强度衰减 I(t) 将由一个简单的指数函数形式来描述：

其中 I(0) 表示初始强度。在这种特殊情况下，τ_F 被称为辐射寿命。然而，如图1 中的 Jabloński 图所示，非辐射过程会与荧光竞争，导致激发态单线态数量的衰减。这些平行运行的激发态衰减过程产生的总衰减速率是所有活性速率常数的总和。让我们把这个总和记为

于是，表观寿命就可以写成

而实验观测到的衰变曲线形式如下

需要注意的是，只有辐射速率常数 k_F（也是τ_F）是与荧光分子息息相关的，而且这个参数是不可能被直接测定的。在荧光衰减曲线测量（也称为寿命测量）中，可以直接测定的是τ_Decay 。另外，k_NR 和 k_Q 通常都取决于溶解荧光染料的分子环境。例如，溶剂的极性、pH 值、溶解氧含量、离子的存在以及氢键的能力都会对 τ_Decay 产生很大影响，这也是很多微环境荧光探针的设计原理。

以广泛使用的荧光体荧光素为例，只有当荧光素溶解在 pH 值大于 10 的水溶液中时，才能观察到其寿命为 4.1 ns 的单指数衰变。在这些条件下，作为二羧酸的荧光素会完全解离，呈双阴离子形式。而当这种染料溶解在微酸性缓冲液中时，观察到的衰变曲线是三种不同形式的荧光素共同作用的结果。虽然衰减率对环境的敏感性有时会使分析复杂化，但它也能探测生物样本中荧光分子的微观环境。

雅布伦斯基图也有助于理解荧光量子产率 Q_F 的概念。Q_F 的定义很直观：它是发射光子数与吸收激发光子数之比。如果荧光是激发 S1 状态的唯一衰减过程，那么所有激发光子都将转化为荧光，Q_F 将等于 1。由于上述相互竞争的非辐射衰变过程，一部分激发态种群会通过其他途径返回基态，而不会发生光子发射。利用相应的速率常数，Q_F 可以表示为

按照下面的方法重新排列后，最后一个等式的意义就显而易见了：

并认识到 Q_F 和 τ_Decay 是实验观测值。我们必须测量这两个量，才能计算出染料的基本荧光速率常数 k_F。

到目前为止，我们假设了一种最简单的情况，即由无限短的光脉冲启动的单指数衰变。然而，时域寿命测量的技术现实却并非如此。激光脉冲的持续时间是有限的。这意味着时间零点，即 "激发时刻 "并没有精确定义。正确的数据分析还必须考虑到激发的持续时间和时间曲线，因为它会改变衰减曲线，尤其是在衰减的开始阶段。仪器的电子元件也有有限的响应时间，因此必须考虑它们的整体影响。

图 2 显示了一个真实的例子：使用时间相关单光子计数（TCSPC）仪器对溶解在乙醇中的 Oxazin1 和 Oxazin4 荧光（两种红色发射激光染料）混合物的荧光衰减进行测量。激发光源是一个发射 635 nm（红色）脉冲的激光二极管，持续时间约为 80 ps，而收集的是 λ > 650 nm 的荧光。在图 3a 中，数据采用线性强度标度绘制。乍一看，衰减曲线（蓝色）与标准指数衰减函数非常相似。红色曲线是所谓的仪器响应函数（以下简称 IRF），它是在荧光衰减测量后不久使用同一台仪器测量散射激光光子得到的。IRF 看起来确实像一个尖锐的短脉冲。

图2b将坐标更换成了更适合TCSPC衰减测量分析对数坐标，从这张图种就可以发现更多有用的细节。首先如果衰减曲线是指数型的话，那么图中应该显示的是一条直线，但在这里可以看到蓝色的曲线明显是弯曲的，这表明衰减曲线并不是单一的指数型，而是与预期相符的双指数衰减。此外，可以清楚地看到IRF（红色曲线）上有一个肩峰，同时激发脉冲的形状不对称，这可能是由于数据采集过程中不可避免的噪声引起的IRF和衰减曲线的背景（偏移）。

尽管激光脉冲的光持续时间约为80皮秒，但采集到的IRF比它宽得多，半峰宽度超过300皮秒，这种现象是由检测器和仪器电子设备引起的，荧光衰减曲线也会受到相同的影响。这也是为什么我们需要同时使用荧光和IRF曲线进行数据分析，以评估拟合模型的衰减参数。

但我们如何知道哪种衰变模型适合拟合数据呢？对于未知样本，合适的衰变模型也是未知的。在上述二元染料混合物的示例中，每种染料都具有单指数衰变，因此选择双指数函数既简单又合乎逻辑。而对于一般的未知情况，通常从最简单的单指数衰减模型开始，如果模型不合适，就逐步增加一个或多个指数项。不过，模型必须尽可能简单。实际上，只需使用五个指数项就可以很好地描述任何衰变曲线，但这并不一定意味着这是一个正确的衰变模型。例如，衰变曲线可以是非指数型的，还有一些情况是衰变时间呈某种连续分布。

导致单个荧光团（探针或标签）出现多指数或更复杂的衰减曲线的原因有几种。首先，样品中可能存在一些荧光杂质，这会对衰减曲线产生影响。其次，在生物学中，非常常见的是发射器环境的异质性，这意味着不同的分子可能处于不同的环境中，从而导致不同的荧光寿命。这也是为什么观察到的寿命会受到环境的影响。

另一个可能的原因是能量转移，即FRET。FRET是一种用来测量分子之间距离的过程，在生物学中广泛应用。当供体分子的荧光被检测到时，FRET会导致淬灭过程，并缩短供体的寿命。需要记住的是，不是所有供体分子都会发生FRET，因此一部分供体会以其原始未淬灭的寿命发光。此外，FRET的速率和效率与供体和受体之间的距离密切相关，因此供体-受体距离的分布会导致观察到的供体寿命分布。如果在供体选择性激发后监测受体的荧光，那么FRET可以看作是受体的中继激发，导致受体荧光衰减曲线中出现一个上升分量，需要额外的负振幅指数项来描述。荧光动力学是一个复杂的领域，需要深入研究。如果需要更多详细信息，可以参考相关教科书和文献。