细胞就像一个复杂的工厂，各种亚细胞结构就像精密的仪器，具有不同的功能，并不断地协同工作以维持细胞正常的生理活动。亚细胞结构异常可导致细胞生理功能的改变，进而导致各种疾病。因此，研究这些亚细胞结构的精细结构和功能对生物医学的发展具有重要意义。超分辨荧光显微成像技术的发展使利用荧光显微镜研究细胞内200纳米以下的亚细胞超微结构成为可能，这极大地促进了生命科学和生物医学的发展。而实现活细胞超分辨成像不仅需要先进的成像系统也需要具有优异光学性能的荧光探针来标记各种亚细胞结构。常用的荧光探针主要分为荧光蛋白和有机荧光染料两大类。相较于荧光蛋白，有机荧光染料具有荧光亮度高、光稳定性好等优点，更适合超分辨动态成像。本篇综述简要介绍了常见的超分辨成像系统的原理及其对荧光探针的要求，并概述了最近几年开发的可用于活细胞超分辨成像的荧光染料，此外总结了高性能非透膜探针的活细胞递送方法。
▌ 各种超分辨荧光显微成像技术对荧光探针的要求
1. 单分子定位显微技术（SMLM）
对于活细胞SMLM成像系统，荧光探针除了能够特异性标记活细胞亚细胞结构外，还需要有“开-关”行为（图1a），而单个荧光探针应该具有足够高的亮度和良好的光稳定性，以确保在图像中准确检测和定位并且经历足够数量的开关周期，从而确保检测到大量的单个分子。
2. 受激辐射损耗显微技术（STED）
活细胞STED成像需要荧光探针具有特定的性质。首先荧光染料的发射峰应与激发和损耗光束的波长相匹配（图1b），以确保效果最大化。此外，荧光探针必须具有优异的荧光亮度和光稳定性，以确保它们能够经历多次激发和损耗循环而不会发生明显的光漂白。
3. 结构照明显微技术（SIM）
虽然SIM成像技术本身对荧光基团没有特殊要求，但其成像原理需要对9张原始图像进行重建才能生成1张超分辨图像，这需要比传统荧光显微镜多获取9倍的数据（图1c）。因此，为了实现对活细胞亚细胞结构的快速、长期的SIM动态成像，对荧光探针的抗光漂白能力和荧光亮度提出了更高的要求。
图1.（a）SMLM技术原理 [Chem. Biol. 20(1), 8–18 (2013)]；（b）STED技术的原理；（c）SIM技术原理 [J. Biotechnol. 149(4), 243–251 (2010)]
1. 有机荧光探针的识别基团
荧光探针中荧光染料的性能对最终的超分辨成像结果有重要影响。与荧光蛋白相比，有机荧光染料具有荧光强度高、物理尺寸小、光稳定性高、易于修饰等优点，更适合超分辨成像。然而，有机荧光染料通常不能特异性靶向不同的生物分子，通常需要与特定的识别基团共价连接才能实现特异性标记（图2a）。但是这些识别基团的数量相对较少，从而限制了有机荧光染料在细胞生物学中的应用。随着标记技术的发展，研究人员开发的SNAP-tag、CLIP-tag、TMP-tag和Halo-tag标记技术解决了有机荧光染料缺乏特异性的问题（图2b），极大地扩展了有机荧光探针在生命科学中的应用。
图2. （a）常用的各种亚细胞结构的化学识别基团；（b）SNAP、CLIP、Halo和TMP底物的化学结构
2. 用于活细胞超分辨成像的细胞膜渗透性有机荧光探针
由于细胞膜具有选择渗透性，并不是所有的荧光染料都能进入活细胞。本文主要综述了适用于活细胞超分辨成像的荧光染料。
HM-SiR的自发闪烁荧光团是常用的SMLM的有机荧光染料（图3a），后续不断发展了其他优秀的SMLM有机荧光染料，包括，FRD、SDMAP、HM-JF525、HM-DS655、Yale676sb等（图3b）。最新发展的磺胺基氨基染料STMR和SRhB，具有高激发效率和高光稳定性，适用于活细胞SMLM成像。
用于活细胞STED成像的荧光探针也有严格的要求，它们不仅要具有优异的光稳定性和细胞膜渗透性，而且要能够在损耗光束下从激发态过渡到基态。罗丹明基ATTO647N被广泛用作STED纳米显微镜的探针。然而，ATTO647N与细胞膜非特异性结合，这可能会影响成像结果，因此研究人员相继开发了一系列优秀的适用于STED的染料，包括：具有高光稳定性和细胞膜渗透性的Abberior STAR 635染料；具有高荧光亮度、光稳定性和良好的细胞膜渗透性的510R和580R染料；具有优秀细胞膜渗透性和荧光性能的MaP555、MaP618和MaP700染料（图3c）；具有高光稳定性的4-580CP和4-610CP染料以及低毒性的PaX 560染料。这使活细胞STED成像成为可能。
随着SIM技术越来越多地应用于活细胞成像，研究人员发现活细胞SIM成像也需要高性能的荧光染料。为了避免在成像过程中出现伪影，需要荧光探针具有优异的荧光亮度。此外，活细胞SIM系统通常用于长时程动态成像，这对染料的光稳定性提出了更高的要求。目前，适用于活细胞SIM长期超分辨成像的荧光染料主要是SiR和JF染料。
图3.（a）HM-SiR的开关原理；（b）内酯-两性离子平衡常数(KL-Z)理论原理；（c）罗丹明衍生物提高细胞膜渗透性和荧光性能的机理；（d）使用球珠搭载法将SNAP-Alexa 647送入活细胞进行SMLM成像 [Nat. Methods 8(6), 499–508 (2011)]；（e）细胞穿膜肽与探针的共价耦联用于活细胞荧光探针递送 [Nat. Commun. 5(1), 5573 (2014)]；（f）纳米注射原理 [Nano Lett. 15(2), 1374–1381 (2015)]；（g）PV-1向活细胞递送探针的示意图 [Light Sci. Appl 8(1), 73 (2019)]
3. 用于活细胞超分辨成像的不透膜有机荧光探针
一般而言，亲脂性越高的荧光探针具有更好的细胞膜渗透性，而水溶性越高的荧光探针在水环境中往往具有更好的荧光性能。然而，荧光探针往往难以在亲脂性和水溶性之间找到平衡。许多不透膜荧光探针虽具有优异的光稳定性、水溶性和荧光亮度，但由于缺乏细胞膜渗透性只能用于标记固定死细胞或活细胞的外膜，限制了其使用范围。
开发在活细胞中使用不透膜有机荧光探针的方法可以扩大超分辨成像探针的选择范围。Sara A. Jones等人采用球珠搭载法将不透膜有机荧光探针BG-Alexa 647送入活细胞，实现了网格蛋白包被小泡的三维超分辨动态成像（图3d）。其他物理方法，如电穿孔，微纳米注射（图3f）未来可能用于活细胞的超分辨成像。张玉慧等人在国际上率先创建了基于新型细胞穿膜肽运载不透膜有机荧光探针进入活细胞实现荧光标记的新方法，将多种不透膜有机荧光探针有效地递送到活细胞中，并特异性标记各种亚细胞结构，实现了多种亚细胞结构的超分辨动态成像（图3e, g）。
此外，最近的研究表明，一些不透膜探针染料，如Rho565，在与CA(Halo-tag的识别基团)偶联后也可以实现活细胞标记，但其细胞膜渗透性机制有待进一步研究。
荧光探针是荧光成像技术中不可缺少的工具，对最终成像质量有重要影响。然而，实现活细胞亚细胞结构超分辨成像对荧光探针的光学性能提出了严格的要求。用于活细胞超分辨成像的理想荧光探针应具有优异的光稳定性、高荧光量子产率、良好的水溶性、满足超分辨系统特定要求的能力(如在损耗光下自发闪烁或猝灭)，以及优异的细胞膜渗透性。研究人员已经开发了许多方法来增加现有有机荧光探针的细胞膜渗透性，从而扩大了用于活细胞成像的荧光探针选择范围，并促进了多色活细胞超分辨荧光显微技术的发展。然而活细胞有机荧光探针的设计通常需要在荧光性能上做出一些妥协，以平衡细胞膜渗透性。相比之下，结合了细胞穿膜肽的不透膜有机荧光探针活细胞递送技术，不依赖于荧光探针本身的细胞膜渗透性，从而进一步提高了探针的荧光性能，扩大了可用于活细胞成像的荧光探针数量。
Organic fluorescent probes for live-cell super-resolution imaging
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Published:
volume 16, Article number: 34 (2023)
https://link.springer.com/article/10.1007/s12200-023-00090-3
