【超分辨】超分辨显微镜的前世今生-海南省生物材料与医疗器械工程研究中心

【超分辨】超分辨显微镜的前世今生

发布时间：2024-02-06 发布者：浏览次数：

Abstract

图解：心肌细胞的渲染，肌动蛋白显示为洋红色，α-肌动蛋白显示为绿色，通过斜平面结构照明显微镜 (OPSIM) 成像。[J.B. Hayes, Vanderbilt Univ. / R. Fiolka, F. Zhuo, UT Southwestern Med. Ctr.]

1850 年代末，德国企业家卡尔·蔡司 (Carl Zeiss) 不得不面对着窘迫的实验环境，他在耶拿的工作室才开始制造简单的低倍率微镜，当时的设计是基于艰苦的试验和错误，没有数学基础。

为了保证有更高效、更科学的实验过程，蔡司聘请了一位年轻的物理学家恩斯特·阿贝来研究这个问题。阿贝有了一个突破性的结论：尽管工作室尽了最大努力，但由于光的衍射，显微镜的分辨率总是会达到极限。他于 1873 年发表了今天被称为阿贝衍射极限的理论，该极限指出，两个被照亮的物体只有在相距大于光波长一半的距离时才能被分辨。

一百多年来，阿贝衍射极限经受住了时间的考验，人们试图通过共焦和多光子显微镜等技术来克服它但都无功而返。谁也没想到在2000 年，罗马尼亚裔德国物理学家 Stefan Hell 巧妙地绕过了这一障碍，首次进行了受激发射损耗 (STED) 显微镜实验演示。Hell 早在几年前就将 STED 概念公之于众，虽然引起了很多争议，但面包酵母和大肠杆菌的 STED 图像表明这个想法确实有效。该论文大胆地宣布：“远场荧光显微镜中导致有限焦斑尺寸和有限分辨率的衍射屏障已从根本上被打破。”

后来，Eric Betzig和William Moerner的工作另一种超越阿贝极限的成像方法奠定了基础。2006 年，Betzig 报道了单分子定位显微镜 (SMLM) 的使用——Moerner 发现单个分子的荧光可以通过光控制——以远高于衍射极限的分辨率对溶酶体膜进行成像。八年后，Hell、Betzig 和 Moerner 因开发了全新的光学成像类别：超分辨率显微镜，而共同分享了 2014 年诺贝尔化学奖。

超分辨率革命为生物学家提供了前所未有的利用光观察细胞内部的方式，而研究人员也在不断突破该技术的界限。

从那时起，超分辨率革命使生物学家能够前所未有地用光观察细胞内部，其细节水平足以观察亚细胞和亚细胞器现象——以前只能通过电子显微镜才能实现。研究人员不断突破该技术的界限，发明新的成像机制并进一步提高空间和时间分辨率。

阿贝衍射极限

在耶拿的Friedrich Schiller大学，校园内的一个大石球上刻有阿贝著名的最小距离d表达式，可以通过光学显微镜解析：d = λ /(2 n sin α)，其中 λ是观察到的光的波长，n是浸没介质的折射率，α 是物镜可以捕获来自样品的光的圆锥角。

实际上，d 的范围通常为远蓝光的 200 nm 到远红光的 350 nm。这意味着科学家可以观察一些细胞器的轮廓，例如线粒体。但任何较小的东西——病毒；蛋白质和小分子的精确分布；诸如神经突触之类的精细细胞结构无法用光来解析。

第一项有意义地超越阿贝衍射极限的技术是 STED，由 Hell 于 1994 年提出。STED 使用两个激光器，一个用于激发样品中的荧光，另一个具有环形（甜甜圈形）光束的激光器。环形激光器用于淬灭除中间纳米尺寸体积（“甜甜圈孔”）之外的所有荧光。光束扫过样品，从纳米尺寸的微小圆环孔中创建出全面的图像。亚衍射分辨率取决于受激发射过程的效率，而受激发射过程的效率很大程度上取决于耗尽光束的强度。

SMLM——实际上指的是一系列超分辨率技术——利用单个分子的定位来构建整体结构。Moerner在测量单个荧光团方面的革命性工作有效地表明，如果可以高精度定位单个分子，那么两个彼此非常接近的分子也可以高精度定位——只要它们可以在不同时间发出荧光。

Betzig 在光激活定位显微镜 (PALM) 中利用了这一想法，其中弱光脉冲仅激活样品中的一小部分荧光蛋白。漂白或关闭它们后，可以激活新的子集。该过程重复多次，并对所得图像进行处理和叠加以生成单个超分辨率图像。另一种 SMLM 方法是随机光学重建显微镜 (STORM)，它依赖于固有或诱导闪烁有机染料而不是荧光蛋白的成像。

STED和SMLM都取得了令人印象深刻的结果，STED的横向分辨率为20至40 nm，轴向分辨率为70 nm，SMLM的横向分辨率为10至15 nm，轴向分辨率为50 nm。但两者也都有其缺点。STED 的高强度照明可能会导致活细胞光漂白和可能的光毒性。SMLM 的时间分辨率受到该技术需要获取数千张图像进行单次重建的影响，这使得捕获活细胞的动态变得困难。但研究人员仍在继续寻找新的方法来超越这些限制，并进一步发展超分辨率显微镜。

不一样的甜甜圈

可以说，超分辨率显微镜最近最大的突破再次源自 Hell 实验室，采用了称为 MINFLUX（最小发射通量）和 MINSTED（最小受激发射损耗）的新技术。通过结合 STED 和 SMLM 的优势，MINFLUX 和 MINSTED 提供荧光团本身尺度（1 至 3 nm）的定位精度，提供低于 5 nm 的分辨率。

MINFLUX 最初于 2016 年报道，它像 SMLM 一样随机打开和关闭单个荧光团，然后使用环形激光束确定它们的确切位置，类似于 STED。然而，对于 MINFLUX，环形光用于激发而不是猝灭。位于甜甜圈部分的荧光团会被激发，而甜甜圈孔中的荧光团则不会。然后，计算机算法让 MINFLUX 以分子大小分辨率精确定位每个荧光团的坐标。

牛津大学生物化学系的 Lothar Schermelleh 表示：“从物理学的角度来看，使用 MINFLUX 将单个荧光团实现低至一纳米的定位精度是一项令人印象深刻的壮举。虽然 MINFLUX 的生物学应用性仍然相当有限，主要是单分子追踪，但在未来几年内，在细胞内进行结构生物学应该成为可能。”

与 SMLM 相比，该技术还有其他优势，例如减少定位发射器所需的光子数量以及将时间分辨率提高高达 100 倍。2022 年，Hell 的实验室使用 MINFLUX 显微镜以 1.7 纳米的精度，在不到一毫秒的时间内记录了驱动蛋白-1（一种沿着微管运输细胞货物的运动蛋白）的步进运动。这项工作展示了跟踪单分子动力学并根据 MINFLUX 获得的数据集推断结构变化的潜力。

Hell 的长期合作者、Max Planck研究所的研究科学家 Steffen J. Sahl 表示：“MINFLUX 在分子追踪中实现了亚毫秒级的时间分辨率，从而提供了统计上稳健的追踪数据，以及大量的时间位置采样。用单一染料测量动态运动甚至结构重排的研究正在发生革命性的变化。”

细胞线粒体中的荧光标记蛋白 (Mic60)，使用传统共焦显微镜（左上）、STED 纳米显微镜（左下）和 MINSTED（右）成像。

分辨率从纳米到埃

MINFLUX 背后的一般原理已扩展到其他几种超分辨率显微镜方法。2019 年报道的重复光学选择性曝光 (ROSE) 通过估计发射器相对于移动干涉条纹的相对位置来定位发射器。一年后，研究人员利用正弦照明模式实施了 MINFLUX 概念，创建了 SIMFLUX。这两种技术都很容易兼容大视场成像，并且在相同的光子预算下，定位精度比传统的基于相机的定位提高了两倍。2019 年报道的调制定位 (ModLoc) 显微镜采用了具有移动倾斜干涉条纹的照明调制方法，实现了纳米级的轴向定位精度，并允许在生物样本内进行高达数十微米深度的成像。

Hell 和他的同事在 2021 年推出了 MINSTED。在这个 STED-SMLM 混搭中，MINFLUX 的环形激发光束被环形 STED 光束取代。当荧光团位于圆环孔中间时，荧光团显得最亮。该团队在 2022 年进一步优化了该技术，降低了 STED 光束的功率并进一步提高了空间分辨率。该小组于 11 月发表在《自然生物技术》杂志上的最新研究报道了 MINSTED 实验，该实验以低至 4.7 Å 的精度（略低于半纳米或单个氨基酸的尺度）测量了单个分子的位置。

Sahl 表示：“MINFLUX 和 MINSTED 已经证明，物理学可以实现荧光分子一纳米级或更好的定位精度。在未来几年中，我预测分子长度尺度上任何最后的分辨率障碍都将被打破。”

Leveraging sheets of light

第三类超分辨率显微镜是结构照明显微镜 (SIM)，由已故的 Mats Gustafsson 于 2000 年首创。在 SIM 中，两个或多个光束之间的干涉形成用于照亮样品的正弦图案。已知的照明图案和未知的样品结构产生莫尔干涉图案，其频率低于其分量频率。然后通过显微镜对图案进行成像。

SIM 确实超越了阿贝极限，但与 STED 或 SMLM 不同，分辨率增强本质上仅限于两倍，横向分辨率通常徘徊在 100 nm 左右。然而，SIM 的优势在于时间分辨率高、易于使用以及与大多数荧光团兼容。

德克萨斯大学西南医学院细胞生物学系的 Reto Fiolka 表示：“与其他方法相比，SIM 仍然是一种非常流行的方法，因为虽然它没有最高的空间分辨率，但它在空间和时间分辨率之间形成了良好的折衷。已经有研究以视频速率（每秒 24 帧）甚至更快的帧速率研究细胞器动力学，这对于 STED 或定位显微镜来说确实是一个挑战。”

与更高分辨率的同类产品相比，SIM 对活细胞样本的成像也相当温和。然而，当速度很快时，它仍然需要长时间暴露在相对高的光强度下，因为需要具有不同方向和照明图案相位的多个图像来重建最终的超分辨率图像。包括 Gustafsson 实验室前博士后 Fiolka 在内的研究人员一直在寻找降低 SIM 光毒性和光漂白风险的方法。

OPSIM：速度更快，光毒性更低

2022 年，Fiolka 和同事报告了一种称为斜平面 SIM (OPSIM) 的创新方法，他们认为这种方法有潜力将超分辨率显微镜扩展到快速活细胞成像。该技术将 SIM 与光片荧光显微镜 (LSFM) 相结合，后者使用薄薄的光片仅激发焦点体积内的荧光团。每个 3D 图像仅选择性地照亮整个样品一次，因此与共焦显微镜相比，受到的照射量减少了三到五个数量级。

“使用转盘或共焦显微镜，以及 SIM 显微镜，在样品简单漂白之前通常只能对几十个图像体积进行成像，”Fiolka 说。“在某些情况下，使用 LSFM成像数天到数周，获取了数千张图像。”

此外，由于 LSFM 使用相机进行检测，因此可以并行获取数百万个voxels。只需几秒钟即可记录数十到数千张图像，使其能够以比 STED 或 SMLM 高得多的帧速率运行。

左：在 LSFM-SIM 中，从单个物镜发射的两个光片重叠并产生用于结构照明的干涉图案。右：“图像旋转器”使用振镜来控制结构光片照明，从而实现多次快速拍摄并保持较短的采集时间。

LSFM 的缺点是其空间分辨率适中，横向分辨率通常在 250 nm 至 1 µm 之间。通过与 SIM 相结合，OPSIM 有效地将 LSFM 的分辨率提高了一倍，达到约 150 nm。Fiolka 的团队没有像其他人过去尝试过的那样使用多个物镜，而是开发了一种显微镜，通过从单个物镜以一定角度发射的结构光片来照亮样品。该光片可以旋转以实现SIM所需的多向照明。因此，与传统倒置显微镜一样，样品的获取不受限制。

对荧光纳米球、胶原纤维、组织切片以及癌症和心肌细胞进行的 OPSIM 测试证实，与传统转盘共焦系统相比，其光毒性较低，并且其体积采集速度超过 1 Hz。Schermelleh 指出：“在生物应用和对科学发现的贡献方面，经典的基于干扰的 SIM 方法不断给人带来惊喜，这突显出技术的‘生物相容性’往往会产生影响。”

图像处理技术在超分辨中的应用

深度学习

深度学习（一种基于人工神经网络的机器学习）已成为图像处理和分析的强大工具，包括在显微镜中。超分辨率显微镜也不例外。Schermelleh 认为人工智能的日益普及将使超分辨率显微镜“更加用户友好、强大、自动化和定量”，使其能够“以更经济的方式收获更丰富的信息”。

法国艾克斯·马赛大学 NeuroCyto 团队负责人 Christophe Leterrier 表示：“目前最重要的是超分辨率显微镜的计算方面，特别是使用深度学习增强图像的处理方法的开发。” 他观察到，将深度学习融入到一些标准的超分辨率处理流程中，可以让研究人员用更少的光获取更多信息，从而为对生物样本更温和的成像铺平道路。

对于超分辨率显微镜，研究人员可以使用 ZeroCostDL4Mic 来使用 Deep-STORM，这是一种能够从密集发射器数据集重建 SMLM 数据的深度学习网络。理想情况下，SMLM 需要稀疏的发射器，这意味着数秒到数分钟的长采集时间。具有高密度重叠发射器的区域对算法具有极大挑战，但据报道，Deep-STORM 可以执行快速、精确的图像重建，其分辨率与现有方法相当或更好，有可能显着缩短采集时间。

2020 年，深圳大学物理与光电工程学院Jia Li (李佳) 和同事针对高密度发射器数据开发了一种类似的基于深度学习的重建算法，《Image reconstruction with a deep convolutional neural network in high-density super-resolution microscopy, Optics Express》认为该算法比 Deep-STORM 更适合活细胞成像。深度残差学习 STORM (DRL-STORM) 是一种易于使用的方法，可以提高 SMLM 的时间分辨率。DRL-STORM 捕获活体线粒体中的小管结构，比 Deep-STORM 更清晰、噪音更少，时间分辨率为 0.5 秒。

同时探索了另一个应用程序使用了一种称为双通道注意力网络（TCAN）的深度学习工具，不需要所有额外的努力就可以实现超分辨率显微镜的细节。开发的支持 TCAN 的分辨率增强算法“可以将低分辨率共焦图像直接转换为超分辨率图像，类似于或优于 STED 图像。

在使用实验数据进行训练后，TCAN 模型无需使用特殊仪器或荧光团即可将衍射极限输入图像映射为超分辨率图像。在期刊PhotoniX上发表的一项研究中，研究人员在肌动蛋白微管的多种生物结构和双色共焦图像上验证了 TCAN，将分辨率从 230 nm 提高到 110 nm。此外，他们通过揭示微管的详细结构和动态不稳定性来展示活细胞超分辨率成像。

TCAN（一种用于增强图像分辨率的深度学习框架）呈现的肌动蛋白微管显微图像的共焦显微镜输入（左）和神经网络输出（右）。肌动蛋白微管呈洋红色，细丝呈青色。

超高分辨率与冷冻电镜的结合

除了提高空间分辨率、速度和活细胞友好性之外，研究人员还在解决超分辨率显微镜中的其他挑战，例如对更厚的样品进行成像或将超分辨率显微镜与非光学模式相结合。

在衍射极限显微镜中，由于样品折射率变化和光学设计缺陷造成的少量像差不会显着影响图像质量。然而，超分辨率显微镜依赖于精确的光学性能，即使微小的偏差也会迅速降低分辨率、信号和对比度。因此，“与传统方法中数十至数百微米的深度相比，即使聚焦在几微米的深度，图像质量也会下降”，牛津大学的Martin Booth谈到此处。

Booth 的解决方案是自适应光学器件，他和他的同事已经证明该解决方案可以提高 SIM、SMLM 和 STED 的图像质量。他相信，随着自适应光学硬件的进一步简化和成本降低，更多的研究人员将能够将超分辨率方法应用于更厚的样本，例如组织，而不仅仅是孤立的细胞。

另一方面，Moerner 的团队正在研究一种称为超分辨低温相关光电子显微镜 (srCryoCLEM) 的新兴方法，该方法将超分辨率显微镜与另一项诺贝尔奖获奖技术低温电子显微镜 (cryoEM) 相结合。CryoEM 结合了生物样品的闪冻和计算成像的使用，能够以原子分辨率对生物结构进行 3D 成像。

“CryoEM 是一项非常出色的技术，具有令人难以置信的高分辨率。但问题是，没有具体的非微扰标记策略，”美国 SLAC 国家加速器实验室的 Peter Dahlberg 提到。“这就是协同作用发挥作用的地方，因为超分辨率显微镜的真正标志之一是它能够特异性标记感兴趣的生物分子。” 虽然冷冻电镜和传统的衍射极限光学显微镜已经并用了十多年，但这些技术的分辨率差异很大，限制了其所能完成的工作。尽管仍处于早期阶段，srCryoCLEM 等技术可以帮助精确定位冷冻电镜在纳米尺度上识别的不同生物分子的位置。

正如与冷冻电镜的结合所表明的那样，随着新技术和技巧的不断开发，超分辨率显微镜仍然具有令人惊讶的能力。结果，它使光的能力远远超出了阿贝和他的同时代人的想象。

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