1 背景知识介绍
1.1 组织多聚甲醛固定原理
多聚甲醛（Paraformaldehyde, PFA）是一种化学固定剂，通过在分子之间形成共价键交联来保存组织，多聚甲醛固定组织主要基于两个原理：1. 甲醛能够比较容易溶于脂类物质（细胞有磷脂双分子层）；2. 多聚甲醛能够与细胞内的氨基基团发生化学交联，形成网状结构，从而在一定时间内将细胞内的蛋白固定在某一节段。实验室常用的多聚甲醛浓度为4%，在甲醛在水中溶解时，会发生聚合反应（自动），形成长链的多聚甲醛，其中必须明白一点，这种自动形成的多聚甲醛是一个生产和分解反应同时进行，因此高浓度的多聚甲醛放久以后会有白色沉淀析出。
（图1 多聚甲醛交联蛋白质的化学机制。 Cited: Huimei Wang et al., Cell J, 2019）1.2 酒精脱水（Alcohol dehydration）原理酒精（Alcohol）脱水是指酒精能够促进组织中水分子蒸发或者挥发，基于酒精的溶解性、易挥发、酒精氧原子较强的亲水性（平时大量饮酒的兄dei容易上厕所和大量饮水，就是因为酒精把体内的水带走了），基于上述三个原理就能够比较容易的将组织中的水分子带走。脱水原理的几个关键步骤是：1. 酒精与水分子接触并质子化（protonated），这允许酒精分子与水分子发生物理吸附，形成亲水氢键即质子化；2. 水分子扩散，因酒精的溶解度高，接触了酒精的水分子能够很快扩散到脱水液中，引起组织脱水；3. 水分子的挥发，水分子与酒精接触后，因酒精具有很强的挥发性，会加速组织中水分的挥发。组织透明是指利用透明剂二甲苯既可与脱水剂相融又能和石蜡相融的性质，将脱水剂替换出来，使石蜡能顺利进入材料中，因为石蜡不溶于水；同时，二甲苯是一种在组织学实验室中常用作透明剂的化学物质，在组织组织透明后使载玻片更易于阅读；再者，酒精取代了组织中的水分，二甲苯能与酒精混溶，会取代酒精，石蜡现在可以渗入组织，组织可以继续包埋，以便后期切片处理。值得注意的一点：二甲苯具刺激性气味、易燃，与乙醇、乙醚、氯仿等成分能任意混合，而且长时间吸入也不好，二甲苯蒸气通过肺部吸收，而液体可以通过皮肤吸收，然后一旦进入体内就被肝脏代谢，长时间暴露于高浓度下与呼吸道症状、贫血和其他通常与中枢神经系统问题相关的症状有关，因此在使用二甲苯的时候务必戴好口罩和手套以及实验服。PFA:(4%多聚甲醛)：pH=7.4，固定液适合于绝大多数组织何细胞的固定。所用石蜡要求透明无杂质，新的石蜡要反复70℃熔凝（提前1-2天开始），将沉在底部的杂质除去，用吸水纸擦干净，包埋用过的石蜡要回收反复利用（但不可有组织污染）。烘箱加热（70℃，蜡的熔点约在58-60℃，此法熬的蜡是白色，但温度较低，需更早开始熬蜡，提前3-4天。要加热一周的时间，白天来的时候打开烘箱，晚上走的时候再关）。包埋前溶蜡，进口蜡65度烘箱，国产蜡68度烘箱。溶蜡时长约6小时（前一天采样）。小鼠睾丸，一般整个取样，需要使用注射器穿刺数次扎孔（10-20次左右）以便PFA浸入，使不能破坏白膜，白膜上有空洞但不破坏内部组织（新的针头轻轻戳破白膜即可，刺孔个数根据睾丸大小来确定）。直接将获得的整个睾丸组织使用4%PFA进行固定，固定时间一般在96小时左右，即可完成PFA对睾丸的作用，可用于后期实验。组织固定结束后，用PBS漂洗组织块3×30min（摇床）。目的：洗去渗入组织中的固定液，以免影响组织对组织内部结构的观察、分析、研究。依次用30%，50%，70%，80%，90%，100%（I），100%（II）（梯度脱水，一方面避免组织迅速脱水变性，细胞变形；另一方面使细胞表面与内部均一性脱水）进行漂洗，每次漂洗30min（一直洗到酒精的颜色不是很黄为止）。洗去绝大部分苦味酸浮色（80%以上酒精回收，倒入工业酒精桶，做酒精灯燃料）。在无水乙醇中时间不能太长，否则组织易碎/每次更换脱水剂，将组织块吸干如实验安排原因无法立时完成后续步骤，此步可以经70%酒精后（不建议长期保存），将组织样品存放在75%酒精内，长期保存（长期保存要封口，每个月换一次75% 酒精）。或者对相同样品中的部分样品采取75% 酒精保存，后续另行使用。组织块在高浓度乙醇中，特别是无水乙醇内不能放置时间过长，因为高浓度乙醇吸水能力太强，易造成组织块过度硬化，使切片内组织易碎裂。使用80%，90%，100%（I），100%（II）二甲苯（使用无水乙醇进行配制）各30min，溶出组织内脂肪和多余的酒精。同时二甲苯处理会使组织变脆，时间过长不利于切片；时间过短脂肪残留，染料有可能结合不到蛋白上）（此处不同弄得的二甲苯使用无水乙醇进行配制）透明过程中二甲苯将组织内脂肪和酒精溶出，组织变的透亮，故称为透明。注意事项：乙醇：二甲苯=1：1 浸泡组织2h（于15ml管内）进行预处理，用塑封袋封装后（因为二甲苯会挥发，防止二甲苯挥发进室内），置于摇床上。第一步透明，二甲苯（I），通透组织块5min；第二步透明，更换新的二甲苯（II）（试验中所有的I II成分都一样，目的是多洗一次，让尽量纯净的液体进入细胞中），浸泡约10min（这一步的时间要自己把握，最凭经验的一步，观察通透至组织大部分呈透明样，注意不要使组织样颜色变过深变黑（透明过程既要尽量完全，又不能太过）。浸蜡步骤去除组织中的二甲苯，支撑组织中细胞结构以便后期切片观察，以石蜡代替，浸蜡是否完全直接关系到切片完整。二甲苯：石蜡=1：1，浸泡组织块2h，（68℃烘箱，下同）。更换15ml管，要预热1h左右，再放入组织（可将石蜡、二甲苯倒入15ml管提前预热）；利用二甲苯继续去除残留的脂肪 ，借助二甲苯与石蜡的互溶能力，将石蜡带到原脂肪填充位置，使得石蜡融进组织内 。石蜡（I，可能还含有二甲苯，重复使用的石蜡，也可以用全新的石蜡）浸泡组织块1h，去除组织块中二甲苯。石蜡（II）（从石蜡I到石蜡II 一定要换容器，取出的样品要在纸上滚动一下，都是为了防止二甲苯污染）浸泡组织块2h, 充分去除组织中二甲苯。浸蜡期间，每过30min就要晃动一次15ml管，且烘箱中温度必须严格控制，浸蜡时间不能过长（我一般是浸蜡12-16h左右，即过夜），浸蜡时间或温度过长，会使组织收缩和脆变。浸蜡结束后，将组织块转移到已倒好石蜡的模具中，保证模具不会泄漏，组织块放入后，烘箱内放置30min以上，目的在于：使组织块内石蜡和包埋用石蜡充分互溶，以保证组织块完全包入石蜡同时做好样品标记（若不烘，组织块与蜡块结合不充分，切片时可能会分开）。（图3 立样模具，建议使用这种具有塑性的模具，在蜡块凝固后更容易取出）针对小鼠睾丸，目的是最后可得到睾丸管腔的横切面，这也是整个实验的目的，如果得不到曲细精管的横切面，一切实验都是徒劳）为保证切片时切面为横向管腔，小鼠需要进行立样，使睾丸长轴垂直底面（也可以根据附睾定位睾丸的上下结构，进行上下立样），切记不能让睾丸长界面横躺在立样槽子中。操作时，动作迅速稳定，放置石蜡分层（立样用的镊子要提前放在烘箱中升温）。待睾丸稳定地立在底部后，将模具置于室温下，待冷凝完成，完成后取出蜡块，做好标记。（4℃冷却蜡块中间的凹陷会较深可能会暴露样品，一般常温凝固），自然冷凝完全（冬天一个晚上即12-16h左右，夏天可以延长至24h）。凝固以后使用压脉带（也就是平时医院包扎伤口时候用到的布制胶带）。（图4 收集凝固的石蜡块，标记清楚物种，组别，组织名称。）待蜡块凝固完全后，将蜡块从模具中取出，做好标记。 切片前需对蜡块进行修整，去除组织周围多余石蜡，注意保留组织完整，我喜欢切成宝塔状。（图4 修整蜡块，修成“宝塔状”，这样子有利于切片到最后的时候，不至于将整个组织块切下来，这是来自曾经失败的经验）切片前准备载玻片：清洗干净，先在酸缸中清洗，随后用0.01%多聚赖氨酸（使组织与玻片更好地贴合）孵育15分钟，干燥保存（目前可以购买相关成品的载玻片，可不需要这么繁琐的操作，使用前提前咨询厂家）。切片刀、毛笔、小镊子、玻片架、标记用铅笔、水1L、卫生纸若干。展片水浴锅提前调整到42℃，展片时间必须严格控制（1-2min），否则会导致睾丸生殖细胞/支持细胞从睾丸基底膜脱落。捞片时，须在片子上标明制作人，样品制作时间，组织名称，切片厚度（一般是5-7μm，对于大组织或者比较容易皱缩的组织可适当增加厚度，不超过10μm）。（1）用刀要小心，切片前一定要确认所有的旋钮都已固定死。切片在10μm以下，免疫组化等的片子7μm，也可5μm。（2）切片越薄切出的蜡片越容易形成褶皱，所以利用水的表面张力在水中展片。（4）若切出的一串拉片中有质量不好的蜡片，用手术刀，靠刀片轻轻的转动切断蜡片，注意不能能损伤台座。（5）清除杂质时，毛笔向上扫，千万不能向下扫。否则会在刀片上形成划痕，这样切出的组织上也有划痕，染色会有问题。（6）切出的蜡片呈扇形，多半是因为刀片上有豁口，移动一下刀片。或者就是蜡没有融好，密度不均一。（7）切出的蜡片往回卷，因为有静电。可以事先用75% 酒精擦刀台面，固定蜡块的部位以及蜡块。（8）用镊子夹蜡片的时候不能用力夹，否则蜡片会粘在镊子上。要虚着夹。（11）连续切片基本是同一状态的细胞，同一视野。可以用不同的抗体染色，最后的图组合在一起。若要取多个不同视野观察，可以空切10刀。（12）蜡块在切之前一定要固定好卡紧，否则蜡块会转动不利于切片。（13）使用完机器后要收回固定蜡的装置，上方红绿色长方块消失（用小柄转，一个黑点是一倍，即小柄转一圈相当于大柄转十圈；两个黑点是两倍，即小柄转一圈相当于大柄转二十圈）。（14）切完后先取刀片，再取蜡块，然后用软的卫生纸擦刀台面（刀片用65℃水煮，烘箱烘干除蜡），最后把整个台座都卸下来，将蜡的碎屑清除干净。（15）水浴锅中倒入的是蒸馏水，或者自来水，42℃。（16）片子内各组织尽量离开一段距离，方便做免疫组化时阻断笔分开。（17）片子标注：首先写组织名称，再写样品时间、样品归属人，切片厚度。（18）切片尽量保证一张载玻片上4个左右组织方向一致，在水平线上。（该实验还是比较复杂的，尽可能先和实验室的前辈学习。）
