在对细胞进行成像后，我们往往需要对细胞的数量进行定量，手动数细胞 是一个极其无聊以及耗费精力的工作，而且可能存在人为的bias，可重复性较差。
上一篇文章为大家介绍了ImageJ的安装，以后的文章我会以 实际应用 的方式，解释 ImageJ 在科研图像处理中的各种实例。
▲还记得被红血球计数板支配的恐惧吗
这是解放双手篇的第一篇——利用ImageJ实现，基于阈值分割的自动细胞计数。
▲利用ImageJ进行基于阈值的自动细胞计数的工作流程（Workflow）在进行自动细胞计数之前，需要对 ImageJ 进行初始设置：
（Process -> Binary -> Options）：
▲勾选Black background
这样可以避免二值化后出现Inverting LUT的情况，避免混淆物体和背景。
（File->Open，或者将图片直接拖动到菜单栏）：
▲以一张DAPI免疫荧光染色照片为例
我们的目标是：自动对DAPI染色的细胞核进行计数，得到细胞核的总数。
（Image->Type->8-bit）：
RGB格式简介： RGB代表 红、绿、蓝 三个通道，可以通过这 三个通道的叠加 得到各式各样的颜色。
在 ImageJ 中，RGB的每个通道只支持8-bit，即 256级亮度，用数字表示为从0、1、2...直到255。在0时最弱，而在255最亮。
当我们把一个RGB图像，转换为8-bit图像时，其实就是来了一个简单的缩放。使用以下公式转换为灰度：
灰色=（红色+绿色+蓝色）/ 3
当然对于本文的单通道的图像来说，也可以通过Image -> Color -> Split Channels，提取蓝色通道也是可以的。
注意：如果你的图像在保存时，已经保存成单通道了（8-bit,16-bit），不需要进行这一步。这一步是为了后面设置Threshold。
16-bit的图像可以直接进行Threshold，不用转成8-bit，否则会有亮度信息的损失。可参考公众号关于成像注意事项的文章：
（Image->Adjust->Threshold）：
首先需要解释一下设定阈值（Threshold）的原理：
阈值的本质就是利用物体和背景的信号强度的差异，通过 只选中pixel value在一定范围内的pixel，来分割出物体。
设定好阈值之后，Apply即可将选中物体进行二值化，可以进行后续的形态学操作或者统计。
注意：设置阈值时建议选择Red来进行表征，变为红色的区域就是已经选中的区域。
注意背景是黑的，所以要勾选Dark Background！
这时候可能需要进行两项操作：
（1）如果图像带有比例尺：拖动调节阈值的上限可以去除比例尺（因为自动计数可能会把比例尺也当做细胞来统计）。
所以建议大家成像的时候不要把比例尺印在图像上。
（2）如果自动阈值效果不好：换拖动调节阈值的下限，可以增加选中区域，但要注意在选中细胞核的同时，尽可能少的减少背景。
拖动完成后点击Apply，图片转为非黑即白的二值化（Binary）图片：
▲这里白色区域是分割出的细胞核（pixel value为255）（Process->Binary->Fill holes）：
阈值分割往往并不完美，一些细胞核存在亮度不均匀的部分，这部分可能并不能被阈值选中。
图像转为二值化后，可以进行形态学操作，填补细胞核的空隙，使得细胞核变成实心球形：
▲Fill holes后的结果
（Process->Binary->Watershed）：
细胞密度比较大时，通常会有细胞重叠或者贴近的情况。可以利用Watershed自动将重叠的两个细胞核分离开来：
（Analyze->Analyze Particles）：
出现Analyze Particles界面，通过不同的情况设置参数，最重要的是红框中的参数。Size：300-Infinity——指分析颗粒面积大于300（这里的单位是pixel），一直到无穷大的颗粒。（根据细胞大小，以及结果好坏来更改）Circularity：0.00-1.00——指圆度，可以根据细胞形状，调整需要的圆度，1.00为标准圆。Exclude on edges——处于边缘的颗粒不计入
可以看到最后统计出的细胞核数为141，且每个细胞核的面积也在Results中显示出来。可以放大检查原图中是否有多数或者漏数的细胞。
