在前几期的流式染料图解中，我们知道了市面上常见的荧光染料种类，学习了流式仪器的光学组件及荧光通道光学信号的收集过程，以及如何选择流式染料，但是需要强调的是染料在被相应激发器激发以后，发射的荧光波长并不是一个小光谱区间，一般会是100-200nm的光谱区间。如下图淡紫色区域是BV421(405nm) 染料的被Violet激光器激发后的发射的荧光波长区间，淡红色区域是APC染料的被Red(633nm)激光器激发后的发射的荧光波长区间。
在前几期的流式原理铺垫后，终于可以和大家图解为什么在流式上机和后续分析中，常常需要调补偿，每个染料被激发后发射的100-200nm的光谱区间，不可避免的会有光谱重叠区。如果进一步收集光谱重叠区荧光，则难以判断是由谁激发和发射的，即由A染料发射的波长，在检测B染料时也被收集，即存在染料之间的干扰，或叫荧光溢漏。为了排除这部分干扰，则需要将A染料溢出到B染料检测波长区间的荧光波长去除，还给A染料本身被激发后的发射波长，即荧光补偿。
我们接着看下图，虽然在光谱图中我们看到三种激发器激发的荧光染料（BV421、Alexa Fluor 532、APC）有光谱重叠区，但结合滤光片以后光谱重叠区的波长相对收集少，也就是相互干扰最少，这也就是解释了为什么在染料数量少时，尽可能选择不同激发器激发的染料。而在选用APC和BB700时，则结合滤光片以后光谱重叠区的波长相对收集多，相互干扰较大，不适合同时使用。
不知道大家有没有进一步学习如何选择多种流式染料抗体，比如：我们在进行胞内抗原检测的时候，需要固定破膜，这样荧光染料标记的抗体才能进入细胞内，那也就是要求我们选用的这类荧光染料首先能进入细胞内，首先首选小分子荧光染料，比如FITC/APC等，其次是在固定破膜后不受影响，那就不适合选择复合染料，容易被固定破膜剂解偶联，失去其原有作用，这些信息可以通过下方的参考网页链接进一步学习！上一期的小问题，选用了PerCP-Cy5.5 anti-mouse Ly6G，但是在上机时（仪器型号为：BD FACSymphony A5 SE）发现并没有PerCP-Cy5.5的检测通道名称，这适时候先不要慌，首先确定PerCP-Cy5.5是由Blue488nm激发器激发，使用670/30BP滤光片，所以我找到仪器中的和PerCP-Cy5.5激发器相同，收集光谱最为接近的BB700（BD公司设计的染料，命名规格有逻辑哦，不知道你发现没有~）但机器也并不是收集所有的波长区间，联系我们之前学习的光学组件，滤光片仅能过滤特定区间的荧光，如下图所示，BV421的收集荧光波长区间通常在410-470nm之间，具体也根据所配滤光片而定。APC收集区间则通常是650-670nm之间。
2.https://www.bdbiosciences.com/content/dam/bdb/marketing-documents/lsr_fortessax20_filter_guide.pdf3.https://www.bilibili.com/video/BV1D94y117aX/?spm_id_from=333.337.search-card.all.click&vd_source=890c0759094710d0eae7af4679c541933. 4.https://zhuanlan.zhihu.com/p/4858000365.https://www.bdbiosciences.com/zh-cn/resources/bd-spectrum-viewer
