关于「细胞培养」的基本知识

狄恩基因学习笔记 2024-05-10 15:44

细胞培养(cell culture)是在体外模拟体内温度、酸碱度、营养条件等环境，使之生存、生长、繁殖并维持主要结构和功能的一种方法。细胞培养也叫细胞克隆技术。

培养细胞类型

01 原代细胞(primary cell)：直接从体内取出的细胞、器官或者组织分离出的第一代细胞。更接近于细胞的在体状态和特性，但获取及培养均较难。一般认为，培养的原代的第1代细胞和传代到第10代以内的细胞统称为原代细胞。

02 细胞系（Cell Line）：是由原代培养物经首次传代成功后，在体外培养条件下不断分裂和繁殖而形成的细胞群，特征：1）细胞系通常来自于原代细胞培养物、单个原始组织或细胞的特定个体。该单个细胞通过分裂和传代培养，不断产生相同类型的细胞，形成一个可持续的细胞系。2）细胞系可理解为可连续传代的细胞，其中能够连续传代的细胞叫做连续细胞系或无限细胞系，不能连续培养的称为有限细胞系。3）细胞系常用于探究细胞的生物学特性、疾病机制以及药物开发等，在基础生物学研究、药物筛选等领域广泛应用。

HeLa细胞系是最著名的细胞系之一，被广泛用于医学研究。
海里埃塔·拉克丝（Henrietta Lacks）是一名普通的家庭主妇，和自己的表亲结了婚，生下了5个有听力障碍的孩子，第一个女儿还是先天性痴呆。1951年，她因为癌症去世。她罹患宫颈癌后，肿瘤细胞被医师取走，成为医学上最早经由人工培养的永生不死的细胞——海拉细胞。而这个海拉细胞，就得名于海莉耶塔·拉克斯姓名的缩写——HeLa。她的细胞至今仍然存活，活在全世界不计其数的医学实验室里。海拉细胞成了世界各地实验室里无与伦比的研究工具。分布在世界各地的海拉细胞超过5000万公吨，是逾7.5万项研究的研究对象。

03 细胞株（Cell Strain）是通过选择法、克隆形成法或其他方法从原代培养物或细胞系中获得具有特殊性质或标志物的培养物。大部分情况下为细胞系的某一特定分支或亚群。特征：1）细胞株是原代细胞或细胞系的一个分支，通过特定的处理或分选过程从原始细胞或细胞系中分离而来。2）细胞株可能具有特定的生物学特性或标志，且该特征或标志必须在整个培养期间始终存在。3）细胞株常用于特定的研究任务或生产工艺中，例如，某些细胞株可能更适合生产蛋白质、疫苗或其他生物制品。

04 贴壁细胞&悬浮细胞

根据细胞生长方式，培养细胞可以分为贴壁细胞、悬浮细胞。贴壁细胞指的是生长必须有可以贴附的支持物表面,只有依靠自身分泌的或培养基中提供的贴附因子才能在该表面上生长，繁殖的细胞。悬浮细胞生长不依赖支持物表面，在培养液中呈悬浮状态生长。

活体体内的细胞当离体置于体外培养时，大多数以贴壁方式生长，主要包括一些正常细胞和肿瘤细胞，比如成纤维细胞，骨骼组织（骨及软骨），心肌与平滑肌、肝、肺、肾、乳腺皮肤神经胶质细胞，内分泌细胞，黑色素细胞以及各种肿瘤细胞等。而少数细胞在体外培养时悬浮生长，包括一些取自血、脾或骨髓的培养细胞，尤其是血液白细胞以及淋巴细胞等。

贴壁细胞系可分为 1) 内皮细胞系，例如 BAE-1；2) 上皮细胞系，例如 HeLa；3) 神经细胞系，例如 SH-SY5Y；4) 成纤维细胞，例如 MRC-5。

细胞培养基

细胞培养基是用于支持细胞在体外生长和繁殖的营养溶液。根据不同的需求和应用，细胞培养基分为多种类型，包括合成培养基、天然培养基、无血清培养基，平衡盐溶液等。

01 天然培养基：天然细胞培养基是最早的细胞培养基，直接取自于动物组织提取液或体液，如血浆凝块、血清、淋巴液、胚胎浸出液等，其营养价值高，但成分复杂，差异大、不稳定，来源也受到限制。最常用的天然培养基是血清，尤其是小牛血清，因它含有多种细胞生长因子和促贴附因子。但由于安全性问题，现代细胞培养越来越倾向于使用无血清或减少血清依赖的培养基。

血清主要作用
1) 提供氨基酸、维生素、无机物、脂类物质、核酸衍生物等细胞生长必须的营养物质。
2) 提供激素（胰岛素、肾上腺皮质激素、类固醇激素等），和各种生长因子（成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、血小板生长因子等）。
3) 提供结合蛋白，作用是携带重要的低分子量物质，如白蛋白携带维生素、脂肪、以及激素等，转铁蛋白携带铁。结合蛋白在细胞代谢过程中起重要作用。
4) 提供促接触和伸展因子，使细胞贴壁免受机械损伤，对培养中的细胞起到保护作用。

02 合成培养基：合成细胞培养基是用化学成分明确的试剂配制的培养基，组分稳定，主要包括糖类、必需氨基酸、维生素、无机盐类等。由于天然培养基的一些营养成分不能被合成细胞培养基完全代替，因此一般需在合成细胞培养基中添加5％～10％的小牛血清。

合成培养基组成及作用

1）氨基酸：不同的细胞对氨基酸的需求各异，但几种必需氨基酸细胞自身不能合成，必须依靠培养液提供，如组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸等。此外，谷氨酰胺对细胞的培养特别重要，能促进各种氨基酸进入细胞膜，所含的氮是核酸中嘌呤和嘧啶的来源，还是合成—磷酸腺苷、二磷酸腺甘和三磷酸腺苷的原料，谷氨酰胺缺乏可导致细胞生长不良甚至死亡。

2）维生素：维持细胞生长的生物活性物质，对细胞代谢有重要作用，在细胞中大多形成酶的辅基或辅酶，没有维生素，酶就没有活性，代谢活动将无法进行。维生素分为水溶和脂溶两大类，的培养液中直接采用ATP和辅酶A。

3）葡萄糖：大部分培养基都以葡萄糖作为能量来源之一。

4）无机盐：维持培养基渗透压平衡，参与细胞的代谢活动。主要有Na+、K+、Ca2+、Mg2+等。Na+是细胞外液中最主要的阳离子，对维持渗透压的恒定有决定性的作用。K+主要分布在细胞内液，细胞内K+对于激活某些酶是必需的，并在调节细胞内环境的酸碱平衡上也有极重要意义。Ca2+在细胞外液中的作用是将组织内部细胞之间相互粘着，在细胞内参与许多重要的细胞生理活动，如传导、参与肌肉细胞收缩等。在悬浮培养时，为了减少细胞的聚集和附着，要减少Ca2+的浓度。Mg2+是构成细胞间质的重要成分，对于细胞间相互稳定结合有很重要的意义。磷的化合物对细胞物质代谢和生理功能调控有重要作用。

5）其他成分：肽、核苷、嘌呤等。可帮助细胞的克隆化培养及维持某些特殊细胞系的生长。

常用基础细胞培养基：

03 无血清培养基：指不含任何动物来源的血清成分，以减少潜在的传染病风险和提高实验的可重复性。无血清培养基通常需要添加特定的化学添加剂来模拟血清中的作用。目前已有多种无血清培养基上市，如杂交瘤细胞无血清培养基、CHO细胞无血清培养基、Vero细胞无血清培养基等。无血清培养基通常添加生长附加成分，如激素与生长因子、低分子营养成分和转铁蛋白等促细胞生长的附加成分，一般包括胰岛素、孕酮、硒酸钠、腐胺、转铁蛋白等。

04 平衡盐溶液：通常包括Na、Na3PO4、钾 K、 Ca、Mg和Cl。K和Na调节渗透性和张力，而Mg和Ca保持细胞膜和内部结构的完整性。通过磷酸盐和碳酸氢盐，平衡盐溶液还能控制氢离子浓度，有些还包括葡萄糖等碳水化合物，可以为细胞提供能量。常用的平衡盐溶液有DPBS、HBSS、EBSS。

1）DPBS

即Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline，杜氏磷酸缓冲盐溶液，是生物学、生物化学研究中使用较广泛的一种平衡盐溶液，DPBS和PBS成分类似，区别在于DPBS中Na₂HPO₄与KH₂PO₄的添加量略小于PBS。DPBS主要用于胚胎学方面的研究，可作为胚胎、组织、细胞的漂洗液、冻存液和培养液。可根据需要在DPBS中加入葡萄糖、丙酮酸钠等，以维持培养物的基本营养。

2）HBSS

即Hank's Balanced Salt Solution，Hank's平衡盐溶液，是细胞分离或培养中常用的磷酸盐缓冲液之一，主要成分为NaCl，KCl，KH₂PO₄，Na₂HPO₄，NaHCO₄和葡萄糖，具有维持渗透压、保持pH稳定、提供简单营养等作用，可用于体外实验中组织块、器官或细胞的漂洗、细胞或组织的运输、细胞培养用试剂的配制以及作为细胞计数的稀释液，也可用于细胞摄取、转运等实验。

3）EBSS

即Earle's Balanced Salt Solution，Earle's平衡盐溶液，是细胞分离或培养中常用的磷酸盐缓冲液之一。EBSS专为CO₂环境中的细胞短期维持而设计，主要成分为葡萄糖，NaHCO₃，NaCl，KCl和Na₂HPO₄，具有维持渗透压、保持pH稳定、提供简单营养等作用，可用于体外实验中组织块、器官或细胞的漂洗、细胞或组织的运输、细胞培养用试剂的配制以及作为细胞计数的稀释液，也可用于诱导细胞自噬等。

细胞培养的应用

细胞培养是细胞和分子生物学中使用的主要工具之一，为细胞正常生理学和生物化学研究（例如代谢研究、衰老）、药物和毒性化合物对细胞的作用以及致突变性和致癌性研究提供了出色的模型系统。细胞培养还可用于药物筛选和开发，以及生物化合物（例如疫苗、治疗性蛋白质）的大规模生产。

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