免疫荧光(Immunofuorescence, IF)的原理是利用抗原抗体之间的特异性结合来标记目的蛋白，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成的荧光标记物，再用这种荧光抗体或抗原作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原或抗体。利用荧光显微镜观察标本，荧光素受到激光的激发照射而发出明亮的荧光（红色或绿色），就可以看荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原就抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。此验证手段做的是蛋白水平验证，同 RNA FISH 一样，免疫荧光不仅对单细胞测序不同细胞的 marker 基因结果进行验证，也可以观察到不同 marker 基因对应的细胞群在组织中的空间定位，还可以分析不同蛋白的细胞定位。

主要包括直接法和间接法。直接法是目的蛋白和带有荧光基团的一抗结合，间接法是目的蛋白和一抗结合，然后一抗再与带有荧光基团的二抗结合，通过荧光显微镜可观测到荧光，进而观测到目的蛋白。

图2.免疫荧光技术实验原理示意图

（1）贴壁细胞：
    先将洁净的盖玻片在70%乙醇中进行浸泡处理，然后用干净无菌的镊子放置到培养皿中，用无菌 PBS洗去残留的乙醇。待细胞接近长成单层后取出盖玻片，操作小心，防止细胞脱片。
（2）悬浮细胞：有2种方法，
    ① 先在悬浮液中进行固定步骤，然后把细胞滴加在载玻片上，干燥后细胞会紧贴在载玻片上。
    ② 先在悬浮液中进行固定和染色步骤，离心洗脱，然后用移液管移至盒式玻片进行后续染色步骤。

（3）冷冻切片：

切片放置在载玻片上后，可以直接进行固定等后续操作。

（4）石蜡切片：

免疫荧光中石蜡切片较少，要先进行脱蜡和抗原修复处理。

固定剂大体可分为两大类：有机溶剂和交联剂。有机溶剂（甲醇、乙醇、丙酮等）能去除脂类物质使细胞脱水，把蛋白质沉淀在细胞结构上。交联剂（4%PFA、10%中性福尔马林），交联剂一般通过自由氨基基团把生物分子桥连起来，形成一个相互连接的抗原网。固定液的选择取决于被研究抗原的性质及所用抗体的特性，不过，目前甲醛用的还是最多的，但针对磷酸化的抗体，应选择冰冷的无水甲醇或无水乙醇。固定时间：取决于组合块的大小和类型，对于大多数组织，18-24h较为理想，细胞固定时间较短，一般2%的甲醛室温固定20min即可。

（当组织细胞死亡时，细胞发生分解，从其溶酶体和其他细胞器中释放的酶，可以水解组织，这一过程称为自溶。为了避免这种情况，固定组织细胞很有必要。目的是保留组织的原始结构，维持细胞形态和抗原的细胞分布）

0.5%TritonX-100室温通透20min（针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则省略该步骤）微波炉加热：在微波炉里加热枸橼酸钠缓冲液至沸腾后将组织切片放入，至抗原修复液自然降至室温。

（目的是为了让抗体能与抗原有机会相见。因为免疫染色的基本原理就是让抗原抗体相结合，然后标记的抗体通过发荧光，使得我们可以对目的蛋白进行定性或定量分析。如果要检测的抗原在细胞膜外表面或细胞外基质，那么可以省去破膜步骤。因为在不破膜的情况下，抗体也能有机会与抗原结合。但是，如果需要检测的抗原在细胞内，则需要破膜，将细胞暴露于针对目的蛋白的第一抗体，以确保抗体可进入表位。)

通透后用PBS浸洗玻片3次，每次3min，吸水纸吸干PBS，在玻片上滴加山羊血清，室温封闭30min。常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或者是羊血清。从封闭开始所有的步骤，一定要注意样品的保湿，避免样品的干燥，否则极易产生较高的背景。

（封闭是使一抗的非特异性结合最小化的重要步骤。在使用特异性的一抗与目的蛋白结合的过程中，如果有非特异性结合，则可能出现假阳性结果，较强的背景染色也会干扰目的染色的呈现，影响实验结果的判断。从理论上讲，任何不结合靶抗原的蛋白质都可以用于封闭。血清是一种常见的封闭剂，因为它含有与非特异性位点结合的抗体。用血清或蛋白质封闭剂封闭可防止抗体与组织或Fc受体非特异性结合）

根据一抗的说明书，按照适当比例用一抗稀释液稀释一抗，用吸水纸吸尽封闭液，每张玻片滴加稀释好的一抗并放入湿盒，4℃孵育过夜。回收一抗，加入PBST，在摇床上缓慢摇动洗涤5min，共洗涤3次。

（这一步需要注意的是一抗是抗什么物种的。如果组织细胞来源是小鼠，则一抗应该是某种动物抗小鼠，这里的某种动物是指一抗宿主，比如，一抗是羊抗小鼠，羊便是一抗宿主。）

用吸水纸吸尽洗涤液后滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中孵育1h后，回收二抗，接着用PBST洗3次，每次5min；由于荧光容易淬灭，故从加荧光二抗起，后面所有操作步骤都要避光。

（第一抗体孵育后，洗掉未结合的一抗抗体，便可以进行一抗与二抗的结合。二抗应该是针对第一抗体宿主物种的，荧光标记的第二抗体。如果进行的是双染，就要注意一抗二抗宿主的选择，不要使其有交叉结合的可能）

在玻片上滴加DAPI，并注意避光孵育5min，对标本进行染核，然后用PBST洗3次，每次5min，洗去多余的DAPI。

用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察。根据不同的染料选择不同波段的激发光。

（封片是指免疫染色后，使用固定介质将盖玻片粘附到组织切片或细胞涂片上。封片可以保护已染色的标本，以免受到物理损害。进行封片的固定介质也有助于提高显微镜下图像的清晰度和对比度。）

图3.免疫荧光技术实验流程

1、内源性组织背景对照：某些细胞和组织可能有固有的生物学性质，会产生背景荧光，对结果产生影响，例如色素脂褐质。因此在孵育一抗前，应对样品进行观察，确保抗原本身没有信号。

2、阳性对照：用确认含有待测抗原的组织或细胞，与待测标本进行统一处理，结果应为阳性，可证明待测抗原有一定活性并且实验过程中用的试剂及方法均可靠。

3、阴性对照：与阳性对照相反，用明确不含有待测抗原的细胞或组织切片染色，结果若为阴性，可排除染色过程中由于非特异性染色造成的假阳性结果。

Q1.信号微弱或没有信号？

一般遇到这种情况，可能是实验操作问题，包括实验操作不当、样本保存不当、固定不足、抗体用量不合适、一抗孵育时间不合适、错误的通透方法、二抗使用不当、错误的激发波长等；还有可能是蛋白表达问题，目的蛋白需要诱导表达或者表达量低。a. 错误的激发波长：确保激发波长与荧光基团激发光波长相匹配；b. 不兼容的一抗或二抗：注意种属问题;c. 固定过度或不充分：适当调整时间;d. 样本保存不当：注意避光;e. 一抗不好用：建议做阳性对照确认抗体的有效性。

Q2:高背景是什么原因？

对于染色过深，遇到这种情况需要我们做的是优化实验条件，可能是由于封闭不充分、抗体使用浓度过高、抗体孵育时间过长或者孵育温度过高、样本变干、清洗不足、非特异性结合抗体等。总而言之，要想免疫荧光实验结果尽如人意，首先必须要做好实验前的准备，了解蛋白详细信息；接着在实验阶段选择合适的固定剂和通透剂；最后抗体孵育时需摸索出合适的抗体浓度和孵育时间。

a. 洗涤不足：充分洗涤，适当增加洗涤次数;b. 样本干燥：在湿盒中孵育抗体，避免样本干燥;c. 封闭不充分：延长时间或更换封闭液;d. 抗体浓度过高：预实验滴定，确认最佳浓度;e. 二抗非特异性结合：不加一抗，只加二抗，作对照;f. 样本自发荧光：提前检测样本自发荧光情况。

Q3：细胞/组织形态被破坏？
a. 组织切片从玻片上脱落或切片有气泡：适当增加固定时间;
b. 组织切片撕裂或有褶皱：切割刀片不太锋利，考虑重新切片;

c. 固定不充分，自发裂解：增加固定时间，使用交联性固定剂。