免疫荧光（Immunofluorescence，IF）是在免疫、生化和显微镜技术基础上建立起来的一种强大技术，原理是利用荧光标记的抗体作为探针对组织或细胞内特定抗原进行定位和定性分析。IF是一个很好的检测技术工具，用于研究感兴趣的产物如分子、蛋白或糖蛋白的表达、定位、分布和迁移。
虽然一直强调要学 R 语言，但我们没有否认在线数据库的重要性。对于生信小白来说，纯生信是很好的过渡；对于生信老司机来说，有些在线数据库是神助攻。目前来说，生信论文有两种主要套路：①老套路生信分析+复杂湿试验验证，②单细胞、多组学±简单湿实验验证。其中套路一耗时费力不讨好，套路二节时省力门槛高。
我们借助生信论文重点分享如何进行免疫组化结果的呈现。这篇生信论文是探究细胞周期蛋白CDK5在肾癌中的标志物价值，是生信和湿实验结合的论文。生信部分主要是下载了TCGA和GENT、Oncomine中的数据，然后借助SPSS软件进行数据分析和呈现。论文中的湿实验部分也都是常规实验，包括RT-PCR、Western Blot和免疫组化染色 (IHC)。Fig1，从TCGA和GENT下载原始数据，进行统计分析。图A是散点图，图B是从GENT下载，然后借助SPSS个性化处理的。图C和图D是用临床样本验证，RT-PCR和WB的结果同时呈现。整体来说，蛋白表达的差异具有异质性。
为了增加研究的深度，作者将CDK5与明星分子p21联系起来。那么为什么选择p21呢？论文在Introduction部分给出了阐释：Recent studies have revealed that CDK5 suppressed the activities of several cell cycle inhibitors such as p21 and p27, and leading to the over proliferation of cancer cells. 由于CDK5和p21都是胞内蛋白，免疫组化检测其表达是首选。文章呈现免疫组化结果的方式，也是值得我们学习和借鉴的。
首先，在呈现免疫组化结果时，要全景图和局部放大图相结合；标尺或者放大倍数要写清楚；肿瘤组织还是癌旁对照组织要标明；最好抗体名称和抗体使用时的稀释倍数也要写明，这样再呈现出来，绝对是很好的免疫组化数据。如果能够将所有标本中到蛋白表达的水平按照高、中和低水平进行分类（作者在补充数据中呈现了），如果再做个统计图，那就更好了。
这篇生信干湿结合的论文，其中免疫组化结果的呈现还是挺棒的，值得借鉴！比免疫组化更特异的是免疫荧光。直接免疫荧光则是用携带荧光素的抗体直接与抗原反应，形成抗原-荧光素标记抗体复合物。该法优点操作简单，特异性高；但应用范围窄，敏感性低。
间接免疫荧光则先用特异性抗体与细胞内相应抗原结合，再用荧光素标记的二抗与特异性抗体相结合，形成抗原-特异性抗体-标记荧光抗体的复合物。
间接免疫荧光试验的主要步骤包括制备样品、固定、通透、封闭、一抗和二抗孵育和激光共聚焦拍照。
1. 细胞准备。将细胞接种于加有爬片的24孔板中，待细胞长到合适密度进行样品的处理。密度太大，会造成细胞拥挤，形态不佳且边界不清，并且染色背景过深。如果细胞过少会导致细胞活性不佳，易发生非特异性染色。因此，染色时细胞密度最好在60%-70%左右。
2. 固定。使用4%的PFA室温固定30 min。固定液的选择取决于被研究抗原的性质及所用抗体的特性，目前4%甲醛较常用，适用于研究细胞膜蛋白。
3. 通透。固定结束后，用1×PBS洗三遍，加入0.1% TritonX-100 100 μL/片，室温通透10 min。通透的目的是在细胞膜上打孔，让抗体进入细胞内于抗原结合。
4. 封闭。通透结束后，用1×PBS洗三遍，加入10% FBS PBS 100 μL/片进行封闭，防止内源性非特异性蛋白抗原结合。
5. 一抗孵育。将相应的一抗用10% FBS PBS以1：500稀释比例进行稀释，加入稀释好的一抗100 μL/片。室温孵育1 h。
6. 二抗孵育。1h结束后，用1×PBS洗三遍，将与一抗同种属的二抗用10% FBS PBS以1：500或1：1000的稀释比例进行稀释。加入稀释好的二抗100 μL/片。室温孵育1 h。
7. DAPI染核。二抗孵育后，用1×PBS洗三遍，加入DAPI100 μL/片，室温染核10 min。
8. 封片。染核后用1×PBS洗三遍，然后用超纯水洗三遍，在载玻片上滴加防淬灭封片剂，将爬片弃干水后轻轻倒置放于载玻片上，室温避光干燥，-20℃保存。
一抗必须来自不同种属，且荧光标记二抗、一抗的种属要匹配，二抗不能有交叉反应；
注意避光操作，尤其是紫外光的照射，以免荧光淬灭导致假阴性结果；
洗涤过程中，动作要轻柔，防止把细胞吹洗掉；选择合适的细胞密度进行试验。
参考资料：https://mp.weixin.qq.com/s/cudQLLiVEVv2bWdRocdO_g
