BioMolly 细胞奇遇记 2024-04-05 16:53 新加坡
我们经常会在科研过程中遇到各种Blot技术，四大Blot家族主要包括Southern Blot（主要掌握DNA的踪迹）、Northern Blot（主要掌握RNA的踪迹）、Western Blot（主要掌握protein的踪迹），还有不太常见的Eastern Blot（主要掌握protein修饰的踪迹）。Western Blot与Southern Blot、Northern Blot的技术原理差别还是比较大的，这种差别体现在Southern Blot和Northern Blot是基于DNA和RNA分子之间碱基互补配对的特异性识别能力 ，而Western Blot则基于抗原抗体之间特异的免疫反应 。
Western Blot免疫印迹是一个用于蛋白质分析的常规技术，在电场的作用下将电泳分离的蛋白从凝胶转移至一种固相支持物，然后利用抗原-抗体的特异性反应，从蛋白混合物中检测出目标蛋白，从而定量或定性的确定正常或实验条件下细胞或组织中目标蛋白的表达情况。
图1. 各种blot技术（图片源自：Wikipedia）
免疫印迹（Western Blot） 采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。SDS-PAGE 可对蛋白质样品进行分离，转移到固相载体——例如硝酸纤维素薄膜（NC）上。固相载体可以吸附蛋白质，并保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。转移后的 NC 膜就称为一个印迹（blot），用蛋白溶液（如 5%BSA 或脱脂奶粉溶液）处理，封闭 NC 膜上的疏水结合位点。用目标蛋白的抗体（一抗）处理 NC 膜——只有待研究的蛋白质才能与一抗特异结合形成抗原抗体复合物，这样清洗除去未结合的一抗后，只有在目标蛋白的位置上结合着一抗。用一抗处理过的 NC 膜再用标记的二抗处理，二抗是指一抗的抗体，如一抗是从鼠中获得的，则二抗就是抗鼠IgG 的抗体。处理后，带有标记的二抗与一抗结合形成抗体复合物可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白质的位置。
实验大致分为样品制备、电泳分离、转膜、杂交及封闭、信号检测几个部分。
对于Western blotting实验而言，样品处理是关键步骤之一，获得的蛋白样品必须均质、可溶，并解离成单个多肽亚基，且尽量减少相互间的聚集，使其最终仅依赖本身的分子量大小进行分离。当目标蛋白的含量很低时，需要选取目标蛋白含量较高的组织或细胞器（如核抽提物），或者通过免疫沉淀等方式进行富集。通常样品有重组蛋白、细胞和组织等。
电泳分为非变形凝胶电泳和变性凝胶电泳，Western Blotting中常用的是不连续缓冲系统下的 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），该法中由于变性的多肽与SDS结合而带负电荷，在凝胶电泳中迁移率仅与多肽的分子量相关。凝胶的筛分特性取决于它的孔径，而孔径又是灌胶时所用丙烯酰胺和双丙烯酰胺绝对浓度的函数。
根据目标蛋白的分子量选择合适浓度的凝胶，以达到最优的分离效果和分辨率；如有特殊需要，可以使用梯度胶，高浓度丙烯酰胺可以使低分子量蛋白质形成清晰的条带，还能在一块胶内同时分离分子量范围更大的蛋白质。
蛋白质经SDS-PAGE分离后，必须及时从凝胶中转移到固相支持物上，固相支持物能牢固结合蛋白又不影响其抗原活性，而且支持物本身还有免疫反应惰性，这使其比直接在凝胶上检测更易操作，试剂用量更少，更省时，效果更好。
蛋白质从凝胶向膜转移的过程普遍采用电转印法，分为半干式和湿式转印两种模式，与SDS结合的蛋白由于带有负电，在电场中向正极迁移，并最终结合在固相支持物上。两种方法均卓有成效，且各有所长，实验者可根据实验情况不同进行选择。
在进行抗体杂交之前，需要采用异源性蛋白质先对转印膜进行封闭，防止免疫试剂的非特异性吸附，从而降低背景，增加灵敏度，提高信噪比。常用封闭物有脱脂奶粉和 BSA（稀释于不同的缓冲液中），但不同的抗原-抗体反应，封闭条件均不相同，没有适合所有系统的封闭液，具体封闭条件（包括封闭液浓度、缓冲液种类、封闭时间、温度等）需自行优化。
封闭后，目标蛋白便与特异性的一抗进行免疫反应，一抗可以是标记的，也可以是非标记的。标记的一抗与免疫原结合后，可直接进行检测（直接法），降低了背景和非特异性结合，但信号较弱。非标记的一抗配合标记的二抗使用（间接法），对信号有级联放大作用，可以增加灵敏性和信噪比。二抗既可标记放射性同位素，也可标记染料或其他分子，或与酶偶联。常用的酶包括碱性磷酸酶（AP）和辣根过氧化物酶（HRP），通过与底物反应产生光信号。
根据二抗的标记物不同，其显色方法也不同，并通过胶片或影像系统（CCD）收集。较常用的检测系统有 HRP 标记二抗的增强化学发光（ECL）和 DAB 检测系统。
1）蛋白水平的原因
2）转膜的原因
转膜有两种方式:湿转和半干转。湿转的优点是背景较低，转膜效果好，缺点是转膜时间长。而半干转则转膜时间短，缺点是背景高，易造成转膜不完全或烧膜现象。
转膜不完全----可通过增加转膜时间或调整转膜的电压来改进;预染Marker是用来检测转膜是否完全的有效工具。
转膜过度----通常是小分子蛋白，尤其是使用孔径为0.45um的膜时，因此，检测小分子蛋白 (<10kDa) 时应先用0.22um的膜;也可以通过预染Marker来观察是否转膜过度，当转膜过度时，预染Marker可穿透膜而显示在上层滤纸上;还可通过适当缩短转膜时间或调整转膜的电压来改进。
3）封闭和洗膜环节
封闭和洗膜：过度封闭或洗脱会使信号变弱。
封闭时间----一般为室温1h，不要过夜封闭。封闭时间过长，可掩盖抗原位点，从而阻碍抗体与抗原的结合。
洗膜----在此特指一抗和二抗孵育后的洗膜。推荐为洗3次，每次5min。过度洗膜可以使信号变弱。
对于磷酸化抗体的信号弱的改进----可以使用说明书推荐的抗体稀释液；延长抗体孵育时间（4℃孵育过夜）；
4）ECL检测的环节
1）样品
2）封闭和洗脱
3）二抗的正确稀释和孵育
4 ）ECL检测
Western Blot是一种用于检测蛋白质的实验技术，广泛应用于生物学和医学研究中。它可以用来定量分析特定蛋白质的表达水平，检测蛋白质的大小和特异性，并研究蛋白质的修饰状态。
以下是Western Blot在生物学和医学研究中的一些主要应用：
1.蛋白质表达分析：Western Blot可以用来检测细胞或组织中特定蛋白质的表达水平。这对于理解生物学过程中的蛋白质调控、信号传导以及疾病发生机制等方面至关重要。
2. 蛋白质修饰研究：许多蛋白质在细胞内会经历翻译后修饰，如磷酸化、甲基化、糖基化等。Western Blot可以帮助科研人员研究这些修饰在生物过程中的作用。
3. 蛋白质相互作用研究：通过Western Blot可以检测蛋白质与其他蛋白质或生物分子之间的相互作用，从而探究细胞信号传导途径、蛋白质复合物的组成等。
4. 生物标记物检测：在医学研究中，Western Blot可以用于检测特定蛋白质作为疾病的生物标记物，帮助诊断疾病或评估疾病的严重程度。
5. 药物研发：Western Blot也常用于评估新药物的效果。通过检测药物对特定蛋白质的影响，可以评估药物在调节生物过程中的作用。
6. 免疫学研究：在免疫学研究中，Western Blot用于检测抗体对特定抗原的结合，从而评估抗体的特异性和亲和力。
总的来说，Western Blot在生物学和医学研究中是一种重要的分析技术，为科学家们提供了深入了解蛋白质功能和相互作用的工具，有助于解决许多与健康和疾病相关的问题。
